趙文娟，臧佳音，劉俊華，陳躍磊，丁小燕，楊冬，賀福初

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生命組學(xué)研究所，國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心·北京，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院 生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所干細(xì)胞庫(kù)，上海 200031

胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells，ESC）作為一種多能干細(xì)胞，可以分化成多種譜系細(xì)胞[1]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀(guān)遺傳學(xué)和功能研究，對(duì)ESC多能性和自我更新的分子機(jī)制已得到相對(duì)充分的認(rèn)識(shí)[1-3]，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮著重要作用。已知信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控與蛋白水平和翻譯后修飾水平直接相關(guān)，因此利用蛋白質(zhì)組學(xué)（尤其是翻譯后修飾組學(xué)）數(shù)據(jù)進(jìn)一步探索其機(jī)制具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

蛋白質(zhì)磷酸化修飾負(fù)責(zé)調(diào)控蛋白質(zhì)功能、亞細(xì)胞定位和相互作用以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，通過(guò)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]、基因表達(dá)[5]以及蛋白激酶驅(qū)動(dòng)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[6]，影響細(xì)胞周期[7]、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等重要生物學(xué)過(guò)程。ESC（磷酸化）蛋白質(zhì)組的鑒定，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)ESC多能性和自我更新相關(guān)的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。然而，以前的研究由于技術(shù)水平的限制，并沒(méi)有得到較全的ESC（磷酸化）蛋白質(zhì)組[8-11]。隨著磷酸化肽段富集技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)磷酸化修飾的質(zhì)譜鑒定已向高精度、高靈敏度、快速掃描的方向不斷進(jìn)步。在本研究中，基于目前最高水平的磷酸化肽段富集和高精度質(zhì)譜鑒定技術(shù)，我們得到目前較大的H9細(xì)胞（磷酸化）蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集，并對(duì)多能性維持相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了解析。

1 材料與方法

1.1 材料

H9細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所干細(xì)胞庫(kù)提供。尿素購(gòu)自Millipore公司；乳酸、碘乙酰胺、乙腈、三氟醋酸購(gòu)自Sigma公司；二氧化鈦購(gòu)自GLScienc?es公司；胰蛋白酶購(gòu)自Promega公司；蛋白酶和磷酸酶抑制劑Cocktail購(gòu)自ThermoScientific公司；mTeSR1購(gòu)自Stem Cell公司；基底膜基質(zhì)膠（Matrigel）BD、30kD超濾管購(gòu)自Millipore公司；細(xì)胞誘導(dǎo)因子活化素（activin）A及WNT3A購(gòu)自R&D公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)自ThermoScientific公司；SYBRGreenQ-PCR試劑購(gòu)自Toyobo公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)、高分辨率質(zhì)譜儀（Orbitrap Fusion LumosTribrid）（ThermoFisher Scientific公司）；高效液相色譜儀（AgelaTechnolo?gies公司）；真空干燥機(jī)（Eppendorf公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及其分化潛能檢測(cè)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 首先將H9ESC復(fù)蘇到無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板上，即培養(yǎng)在去除基質(zhì)生長(zhǎng)因子Matrigel包被的6孔培養(yǎng)板上，采用mTeSR1培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，之后傳代，繼續(xù)培養(yǎng)4d，待生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí)收集細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分化潛能檢測(cè) 傳代之后的細(xì)胞采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基［DMEM/F12加入15%KnockOut血清替代物（KnockOutserumreplacement，KSR），添加1%非必需氨基酸（nonessentialamino acids，NEAA）、1mmol/LGlutaMAX和55mmol/L β-巰基乙醇］進(jìn)行培養(yǎng)，隨后加入誘導(dǎo)因子100ng/mL活化素（activin）A和 50ng/mLWNT3A，培養(yǎng)至96h，每天更換培養(yǎng)基；期間每隔24h收集一次細(xì)胞。

1.3 免疫熒光檢測(cè)

將細(xì)胞種于24孔板的小玻片上，確保細(xì)胞貼附及延展，待細(xì)胞生長(zhǎng)2～3d后，用1×PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液室溫孵育固定細(xì)胞；用1×PBS清洗細(xì)胞，PBS-T室溫孵育5min；PBS-B室溫孵育1h封閉細(xì)胞，隨后進(jìn)行一抗、二抗孵育；用Hoechst染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色處理，室溫孵育15min，用1×PBS清洗；滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，盡量避免氣泡，使細(xì)胞接觸封片液，封片；用共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照試劑使用說(shuō)明操作。實(shí)時(shí)定量PCR程序?yàn)轭A(yù)變性95℃ 15 min；變性95℃ 15s，退火58℃ 20s（40次循環(huán)）；72℃ 30s（40次循環(huán)）。每個(gè)樣本和基因均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 細(xì)胞收集

用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，加入1mg/mL解離試劑，37℃放置7min；去除解離試劑，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的冰冷PBS吹打收集細(xì)胞，4℃、2000r/min離心5min，去除上清，保留沉淀。

1.6 蛋白提取及還原烷基化

細(xì)胞沉淀中加入含1×蛋白酶、磷酸酶抑制劑的8mol/L尿素進(jìn)行細(xì)胞裂解，冰上放置30min，隨后冰上超聲波破碎，4℃、16000r/min離心5 min，棄沉淀和表層油脂，取上清液，用Brandford法測(cè)定蛋白濃度。取1.5mg蛋白加入DTT（終濃度為 10mmol/L），56℃水浴 30min，降至室溫加入1mol/L碘乙酰胺（現(xiàn)配現(xiàn)用），避光30min，再次加入1mol/LDTT，避光靜置15min，16000r/min離心10min，留取上清備用。

1.7 FASP酶解及肽段抽提

將蛋白上清液轉(zhuǎn)移到2個(gè)30kD超濾管進(jìn)行蛋白裝填，14000r/min離心15min；加入8mol/L尿素，渦旋振蕩，14000r/min離心15min，棄廢液；加入50mmol/L碳酸氫銨，渦旋振蕩5～10 s，14000r/min離心 15min，棄廢液，除去殘留尿素；更換新的套管，加入50mmol/L碳酸氫銨、1 μg/μL胰酶（質(zhì)量比為1/50），振蕩混勻，37℃消化12h；補(bǔ)充添加1 μg/μL的胰酶，振蕩混勻，37℃消化 4～6h，14000r/min離心 10min，收集肽段溶液；取1/10肽段溶液于新的離心管中用于全蛋白sRP-HPLC鑒定，剩余液體用0.1%甲酸酸化處理，之后所有肽段冷凍抽干，-80℃保存。

1.8 TiO2富集磷酸化肽段

凍干的肽段溶解在含1mol/L乳酸的70%乙腈、5%三氟醋酸溶液中，然后在旋轉(zhuǎn)儀上讓肽段在TiO2上完成吸附，依次用30%乙腈、0.5%三氟醋酸溶液，80%乙腈、0.5%三氟醋酸溶液洗滌3次，最后用15%氨水，0%、2%、5%、8%、10%、40%乙腈分別進(jìn)行梯度洗脫各1次，合并為3個(gè)餾分并酸化，除鹽凍干，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定[12]。

1.9 sRP-HPLC全蛋白酶切肽段分餾

用pH10的水（HPLC級(jí)）溶解肽段樣本，按洗脫緩沖液梯度從低到高依次洗脫，即6%、9%、12%、15%、18%、21%、25%、30%、35%乙腈，洗脫之后將6%與25%、9%與30%、12%與35%的洗脫液合并成6個(gè)餾分，之后所有肽段冷凍抽干進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.10 質(zhì)譜鑒定及搜庫(kù)質(zhì)控

1.10.1 質(zhì)譜鑒定 將抽干的磷酸化肽段用10%甲酸重溶（全肽段用0.1%甲酸重溶），14000r/min離心10min，取上清進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。色譜分析柱填料為1.9μmC18粉末，C18反相柱內(nèi)徑150 μm，長(zhǎng) 15cm（Michrom Bioresources）。液相為EASY-nano-LC1200 與 OrbitrapFusionLumosTri?brid（ThermoFisherScientific）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶于水，流動(dòng)相B為80%乙腈加0.1%甲酸，600nL/min流速，梯度 75min（0～16min，3%～10%B；16～51min，10% ～22%B；51～66min，22% ～30%B；66～67min，30%～95%B；67～75 min，95%B）。采用 OrbitrapFusionLumos質(zhì)譜儀分析，在正離子模式下運(yùn)行，離子傳輸管溫度為320°C，正離子噴霧電壓為2.0kV。一級(jí)和二級(jí)采集質(zhì)量范圍分別是300～1400m/z，分辨率為120000，循環(huán)時(shí)間3s。在正?；呐鲎材芰肯逻M(jìn)行HCD碎裂為35%。MS2自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo)設(shè)置為 5e3，最大注射時(shí)間（MIT）為35ms，動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為18s。

1.10.2 搜庫(kù)和質(zhì)控 用MaxQuant軟件（1.6.1.0版本）[13]對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜譜圖進(jìn)行檢索和質(zhì)控。數(shù)據(jù)庫(kù)為Swiss-Prot-Human（2017年11月更新），主要參數(shù)設(shè)置如下：一級(jí)質(zhì)譜容差為20ppm，二級(jí)質(zhì)譜容差為0.5Da，固定修飾為半胱氨酸烷基化（carbamidomethyl，C），可變修飾為 N 端乙酰化（acetylproteinN-term）、蛋氨酸（methionine）氧化（oxidation）及絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾［phospho（STY）］，允許的最大漏切數(shù)設(shè)置為2，肽段最小長(zhǎng)度為7。采用正反混合庫(kù)搜庫(kù)策略，其中肽段假陽(yáng)性率標(biāo)準(zhǔn)為FDR＜0.01；采用無(wú)標(biāo)定量法對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。參照國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)[14]，將磷酸化位點(diǎn) locationprobability≥0.75 定義為高可信度修飾位點(diǎn)（即class1磷酸化位點(diǎn)）。

1.11 生物信息學(xué)分析

1.11.1 功能富集分析 下載每個(gè)基因的GO（GeneOntology）的 BiologicalProcess注釋信息。利用基于超幾何分布模型的富集缺失分析方法，計(jì)算所關(guān)心的基因類(lèi)別參與的生物學(xué)過(guò)程的富集/缺失P值，并基于Benjamini-Hochberg方法進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)的校正。將富集缺失P值取對(duì)數(shù)，根據(jù)富集或缺失確定正負(fù)，富集為正，缺失為負(fù)。對(duì)得到的結(jié)果根據(jù)大小劃分等級(jí)，之后采用R語(yǔ)言中的“pheatmap”程序包進(jìn)行熱圖繪制。

1.11.2 激酶及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 采用iGPS2.0[15]進(jìn)行激酶預(yù)測(cè)分析；所得差異蛋白用信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析（IngenuityPathwayAnalysis，IPA）軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子與靶基因調(diào)控關(guān)系分析；運(yùn)用Cytoscape繪制激酶與底物相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 H9細(xì)胞狀態(tài)及其分化潛能鑒定

為了確定本實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞處于干性狀態(tài)，且具有良好的分化潛能，我們首先利用免疫熒光和實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)多能性和中內(nèi)胚層分化的標(biāo)志分子狀態(tài)和分化潛能進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究所用的H9細(xì)胞中，多能性標(biāo)志分子OCT4顯著高表達(dá)，而中內(nèi)胚層分化的標(biāo)志分子EOMES、內(nèi)胚層分化標(biāo)志分子SOX17處于不表達(dá)狀態(tài)?；罨谹與WNT3A共同誘導(dǎo)24h后，多能性標(biāo)志分子OCT4表達(dá)下降（圖1A），中內(nèi)胚層標(biāo)志分子EOMES表達(dá)，這說(shuō)明分化24h形成中內(nèi)胚層；繼續(xù)誘導(dǎo)分化至96h，OCT4及EOMES的表達(dá)量繼續(xù)降低，此時(shí)內(nèi)胚層標(biāo)志分子SOX17高表達(dá)（圖1A）。在轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)，隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行，OCT4在96h表達(dá)顯著降低（P＜0.0001）（圖1B）；中內(nèi)胚層的標(biāo)志分子EOMES在分化24h表達(dá)量升高200倍（P＜0.01），96h該基因表達(dá)量持續(xù)升高（圖1C）；對(duì)于內(nèi)胚層的標(biāo)志分子SOX17在分化24h有少量表達(dá)，96h時(shí)表達(dá)升高約80倍（圖1D）。綜上所述，本研究所用的H9細(xì)胞處于未分化的多能性狀態(tài)，且具備分化潛能。

2.2 H9細(xì)胞（磷酸化）蛋白質(zhì)組鑒定結(jié)果

為了獲得高覆蓋的（磷酸化）蛋白質(zhì)組，我們采用FASP酶切及TAFT（一種新的磷酸化肽段富集策略）[12]對(duì)H9細(xì)胞進(jìn)行了3個(gè)重復(fù)的（磷酸化）蛋白質(zhì)組鑒定（圖2）。

用Spearman對(duì)3次蛋白質(zhì)組重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)R2＞0.9，P＜2.2e-308（圖3A），說(shuō)明3次生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性較好。對(duì)鑒定到的所有肽段的質(zhì)量容差進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示肽段信號(hào)值波動(dòng)范圍符合正態(tài)分布，質(zhì)量誤差范圍為（-5，5）之間（圖3B）。不同重復(fù)的蛋白Venn圖分析顯示，3次重復(fù)中均鑒定到的蛋白是6986種，其中磷酸化蛋白907種（圖3C、D）。

圖1 H9細(xì)胞多能性及分化的標(biāo)志分子檢測(cè)

磷酸化蛋白質(zhì)組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Spearman相關(guān)系數(shù)R2＞0.8，P＜2.2e-308（圖 4A）。對(duì)肽段的質(zhì)量容差評(píng)估顯示肽段信號(hào)值波動(dòng)范圍符合正態(tài)分布，質(zhì)量誤差范圍為（-5，5）之間（圖4B）。Venn圖分析發(fā)現(xiàn)3次重復(fù)中均鑒定到的蛋白2628種，磷酸化蛋白2539種（圖4C、D）。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的磷酸化肽段富集效率均在95%以上（圖4E）。不同殘基上發(fā)生磷酸化修飾的百分比表明，絲氨酸（S）殘基上發(fā)生磷酸化修飾所占比例最大，為85.7%（圖4F），其次是蘇氨酸，由于酪氨酸的磷酸化修飾需要特殊的鑒定方式，因此在酪氨酸殘基的磷酸化修飾位點(diǎn)所占比例最少，僅為1.1%。

通過(guò)對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)組和非磷酸化蛋白質(zhì)組的綜合分析，在hESC中共鑒定和定量8674種特異的蛋白質(zhì)，包括3898種特異的磷酸化蛋白質(zhì)和13676種特異的磷酸化肽段以及14584個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中11870個(gè)高可信度（class1，即lo?cationprobability≥0.75）磷酸化位點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)在每個(gè)單個(gè)樣品中鑒定了超過(guò)7900種特定的蛋白質(zhì)（圖5A）。為了進(jìn)一步評(píng)估hESC的（磷酸化）蛋白質(zhì)組鑒定的覆蓋范圍，與Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)（2017年11月更新）和Singec等[16]發(fā)表的現(xiàn)有結(jié)果進(jìn)行了全面比較。與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的磷酸化蛋白和磷酸化位點(diǎn)相比，本研究新鑒定了511種磷酸化蛋白（圖5B）和6272個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖5C），這些均未包括在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中。在數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Singec研究的原始數(shù)據(jù)，并采用本研究使用的軟件和參數(shù)進(jìn)行重新搜庫(kù)和質(zhì)控。與Singec等發(fā)表的H9（磷酸化）蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集相比，我們鑒定了更多的（磷酸化）蛋白質(zhì)。本研究鑒定到的（磷酸化）蛋白，磷酸肽段以及class1磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量比Singec等發(fā)表的數(shù)據(jù)多1.3～3.3倍。其中僅在我們的研究中鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)目為2743種（包括2247個(gè)磷酸化蛋白）（圖5D、E），11 314磷酸化肽段和10025個(gè)Ⅰ型磷酸化位點(diǎn)（圖5F、G）。因此，本研究獲得高度覆蓋的H9hESC（磷酸化）蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集，為干細(xì)胞干性維持機(jī)制研究提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)資源。

圖2 H9細(xì)胞（磷酸化）蛋白質(zhì)組學(xué)流程圖

2.3 H9細(xì)胞中干性標(biāo)志分子的鑒定情況

從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度檢測(cè)未分化H9細(xì)胞中多能性標(biāo)志分子的表達(dá)情況，結(jié)果如表1。多能性分子 OCT4（POU5F1）、SOX2、NANOG、DPPA4、UTF1等在蛋白水平均有表達(dá)，但各胚層分化的標(biāo)志分子并未檢測(cè)到，如中內(nèi)胚層的EOMES[17]、T[18]，中胚層的標(biāo)志分子GATA4[19]、HAND1[20]，內(nèi)胚層的標(biāo)志分子SOX17[21]、FOXA2[22]以及外胚層的標(biāo)志分子PAX6[23]等。從蛋白鑒定結(jié)果來(lái)看，本研究所用的H9細(xì)胞確實(shí)處于未分化狀態(tài)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志胚胎干細(xì)胞多能性的分子如DPPA4、SOX2及UTF1均發(fā)生了磷酸化修飾。DPPA4能夠在pT215和pS221發(fā)生磷酸化修飾，UTF1能夠在pS18、pS42和pS54發(fā)生磷酸化修飾。此外，在多能性分子中共鑒定到84個(gè)class1磷酸化修飾位點(diǎn)，其中38個(gè)未收錄在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中。已有報(bào)道在hESC中表觀(guān)遺傳調(diào)節(jié)因子DNMT3A和DNMT3B表達(dá)豐度較高且能夠發(fā)生磷酸化[9,16]，與3種多能性核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2和NANOG之間存在密切的相互作用[24]?？傊?，本研究預(yù)測(cè)到發(fā)生磷酸化修飾的多能性因子的潛在調(diào)控激酶，對(duì)H9中自我更新和多能性維持的轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因之間的調(diào)控關(guān)系有了新的認(rèn)識(shí)。

圖3 H9細(xì)胞全蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)質(zhì)控

圖4 H9細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)質(zhì)控

2.4 H9細(xì)胞中Ⅰ型磷酸化位點(diǎn)基序及激酶預(yù)測(cè)

利用本研究中鑒定到的高覆蓋的（磷酸化）蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集，使用MotifX對(duì)H9細(xì)胞中主要的線(xiàn)性激酶基序（Motif）及激酶（Kinase）進(jìn)行了預(yù)測(cè)。以Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)為背景，H9中鑒定到的11870個(gè)class1磷酸化位點(diǎn)中的9983個(gè)能夠富集到50個(gè)線(xiàn)性激酶基序，包括41個(gè)pS（occur?ance=85，P＜10-6）序列基序和 9 個(gè) pT（occurance=14，P＜10-6）序列基序（圖6A，表2）。此外，還鑒定到14個(gè)未報(bào)道的線(xiàn)性激酶基序，如KXXXXXSP、SXXS、RXSP等（圖6B）。用iGPS2.0進(jìn)一步分析這些線(xiàn)性激酶基序中受調(diào)控的激酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)41個(gè)pS序列基序和6個(gè)pT序列基序能夠被人激酶組中的251種激酶所調(diào)控，其中激酶在胚胎干細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)147個(gè)，包括屬于CDK、MAPK和STKR 激酶家族的 CDKs、Erks、BMPR2和 TGFbR1等（圖6A）。由脯氨酸/精氨酸或脯氨酸/賴(lài)氨酸（堿性氨基酸）介導(dǎo)的基序與包括CDKs、GSKs、MAPK等的CMGC組相對(duì)應(yīng)；相反，由天冬氨酸或谷氨酸（酸性氨基酸）介導(dǎo)的基序?qū)?yīng)于A(yíng)UR和CK2激酶家族（圖6A）。

2.5 H9細(xì)胞中自我更新和多能性維持的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖5 H9細(xì)胞（磷酸化）蛋白質(zhì)組鑒定結(jié)果（A）與數(shù)據(jù)庫(kù)（B、C）和已發(fā)表研究結(jié)果（D～G）的對(duì)比

為了進(jìn)一步探究ESC自我更新和多能性維持的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，重點(diǎn)關(guān)注了已知與自我更新和多能性相關(guān)的13個(gè)調(diào)節(jié)因子，通過(guò)對(duì)激酶-底物關(guān)系和轉(zhuǎn)錄因子-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析，重構(gòu)了這些調(diào)節(jié)因子的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，TRIM28是具有最高連接度（40條邊）的蛋白，表明它具有多種功能。已有研究發(fā)現(xiàn)TRIM28作為Myc/Zfx的共調(diào)節(jié)因子，需要在未分化的ESC中維持基因的轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)[25]。分析發(fā)現(xiàn)9種潛在的激酶可能參與調(diào)控hESC中TRIM28的磷酸化 ，包 括 STK25、PLK1、PKN1、PKM、MAPK7、CSNK1E、CCT2、ATRIP和ABL1。已有研究報(bào)道在hESC中表觀(guān)遺傳調(diào)節(jié)因子DNMT3A和DNMT3B表達(dá)豐度較高且能夠發(fā)生磷酸化[9,16]，與3種多能性核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2和NANOG之間存在密切的相互作用[24]（圖7）。總之，通過(guò)進(jìn)一步預(yù)測(cè)到了發(fā)生磷酸化修飾的多能性因子的潛在調(diào)控激酶，對(duì)H9中自我更新和多能性維持的轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因之間的調(diào)控關(guān)系有了新的認(rèn)識(shí)。

2.6 H9細(xì)胞中磷酸化修飾水平與蛋白質(zhì)豐度之間具有相同或不同趨勢(shì)的蛋白質(zhì)功能特征比較分析

已知磷酸化修飾水平與其相應(yīng)蛋白質(zhì)豐度之間的定量值具有相同或不同的趨勢(shì)，推斷這些趨勢(shì)不一致的蛋白質(zhì)在hESC自我更新和多能性維持中具有不同的功能特征。首先對(duì)肽段的磷酸化修飾水平和其相應(yīng)的蛋白質(zhì)豐度之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的定量值（磷酸化肽段Intensity值和相應(yīng)蛋白質(zhì)的iBAQ值）存在顯著但微弱的相關(guān)性（spearman相關(guān)系數(shù)=0.27，P=7.28e-178，圖8A），這說(shuō)明磷酸化修飾水平確實(shí)與相應(yīng)蛋白總體豐度水平存在較強(qiáng)的不一致性，深入分析二者的不一致性及其功能特征具有重要意義。根據(jù)磷酸化肽段Intensity值的百分位數(shù)（pR_Pho）和對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)總量（pR_Pro）的iBAQ值百分位數(shù)的分布范圍，將“磷酸化肽段-蛋白質(zhì)對(duì)”分成3類(lèi)。第1類(lèi)被定義為Pho＞Pro：pR_PhopR_Pro＞40%；第 2 類(lèi)被定義為 Pho＜Pro：pR_PropR_Pho＞40%；第 3類(lèi)被定義為 Pho≈Pro：|pR_PhopR_Pro|＜=40%（圖8A）。對(duì)這3類(lèi)“磷酸化肽段-蛋白質(zhì)對(duì)”進(jìn)行交疊分析，這些蛋白可以劃分為7類(lèi)（圖8B）。對(duì)5個(gè)主要類(lèi)別的蛋白質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行功能分析。已有研究表明大多數(shù)生物學(xué)過(guò)程大致可分為“物質(zhì)流”范疇和“信息流”范疇[26]，“物質(zhì)流”范疇的蛋白質(zhì)在物質(zhì)轉(zhuǎn)換和運(yùn)輸中起作用，“信息流”范疇的蛋白質(zhì)在信息調(diào)控和轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。在hESC中，發(fā)現(xiàn)蛋白豐度低但磷酸化修飾水平高的蛋白質(zhì)（Pho＞Pro）在生物學(xué)功能上顯著傾向于參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾和代謝過(guò)程調(diào)控等“信息流”生物學(xué)過(guò)程（圖8C），在通路方面則顯著富集突觸小泡周期，軸突導(dǎo)向和Hip?po信號(hào)通路（圖8D）。而高豐度但低磷酸化修飾水平的蛋白質(zhì)（Pho＜Pro）則傾向于參與翻譯或運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過(guò)程（“物質(zhì)流”范疇）（圖8C），在通路方面則主要富集了脂肪酸降解、蛋白酶體和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路（圖 8D）。“Pho≈Pro”類(lèi)蛋白質(zhì)則更傾向于參與“信息流”范疇的生物學(xué)過(guò)程，包括蛋白質(zhì)翻譯后修飾、免疫反應(yīng)和細(xì)胞通訊，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Rap1/鈣信號(hào)通路和內(nèi)吞作用通路（圖8C、D）。

表1 H9細(xì)胞干性標(biāo)志分子的鑒定

表1 H9細(xì)胞干性標(biāo)志分子的鑒定（續(xù)）

圖7 hESC已知多能性因子激酶與底物及轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

表2列出了3種類(lèi)別中涉及到的多能性相關(guān)蛋白質(zhì)的功能和信號(hào)通路，這些結(jié)果表明，蛋白豐度和特定磷酸化水平顯著不同的蛋白質(zhì)具有不同的生物學(xué)功能類(lèi)型。值得注意的是，與干性維護(hù)相關(guān)的已知監(jiān)管機(jī)構(gòu)分布在3個(gè)不同類(lèi)別中。例如，胚胎干細(xì)胞多能性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)SALL4/OCT4成員SALL3[20]和人胚胎干細(xì)胞多能性基本調(diào)節(jié)因子 FOXO1屬于“Pho＞Pro”類(lèi)別，表明這2種轉(zhuǎn)錄因子在特定殘基上發(fā)生更高的磷酸化修飾以滿(mǎn)足其調(diào)節(jié)功能。LIN28A[25-26]和TRIM28[27]作為ESC中控制自我更新的調(diào)節(jié)因子，屬于“Pho＜Pro”類(lèi)別。LIN28A是一種翻譯增強(qiáng)子，可將特定的mRNA驅(qū)動(dòng)到核糖體上并提高蛋白質(zhì)合成的效率，這是“物質(zhì)流范疇”的過(guò)程。TRIM28（也被稱(chēng)為KAP-1）是一種轉(zhuǎn)錄中介因子，作為各種轉(zhuǎn)錄因子，特別是含有KRAB的鋅指蛋白和核小體重塑復(fù)合物的支架。由于TRIM28的多功能性，它傾向于高表達(dá)。另一方面，由于它只是一個(gè)腳手架，因此并不需要很高的磷酸化修飾水平。轉(zhuǎn)錄因子SOX2是多能性核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[5,28-29]的成員，CTNNB1是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵下游成分[30]，屬于“Pho≈Pro”類(lèi)。這些因子的蛋白質(zhì)豐度和磷酸化水平往往相對(duì)較高。這種現(xiàn)象表明其蛋白量和磷酸化水平的對(duì)其發(fā)揮功能具有同等的重要性。不同干性分子在這3類(lèi)中均有分布，這表明胚胎干細(xì)胞在維持自我更新和多能性過(guò)程中對(duì)于不同的蛋白豐度及其修飾水平具有不同的需求。

圖8 H9細(xì)胞中相同或不同磷酸化修飾水平與相應(yīng)蛋白豐度之間的功能特征及信號(hào)通路比較分析

3 討論

我們采用最新的磷酸肽富集和高精度質(zhì)譜鑒定技術(shù)，得到了目前覆蓋度較高的H9細(xì)胞（磷酸化）蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。同已有的胚胎干細(xì)胞蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)相比，本研究鑒定到更多磷酸化蛋白及高可信磷酸化位點(diǎn)，為胚胎干細(xì)胞的（磷酸化）蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了資源?；诖藬?shù)據(jù)集的深入分析，得到了hESC中富集的磷酸化修飾基序及相應(yīng)的激酶，發(fā)現(xiàn)了與hESC自我更新和多能性相關(guān)調(diào)控因子的新的磷酸化修飾位點(diǎn)及其相應(yīng)激酶，結(jié)合其對(duì)靶基因的調(diào)控信息，構(gòu)建了ESC干性維持相關(guān)的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾水平和蛋白總量水平不一致提示其不同的功能特征。本研究發(fā)現(xiàn)的重要蛋白質(zhì)新的磷酸化修飾的具體功能還有待深入探究。本研究提供的數(shù)據(jù)資源和分析思路為深入解析胚胎干細(xì)胞多能性和自我更新的機(jī)制具有重要意義，結(jié)合其他組學(xué)數(shù)據(jù)再進(jìn)行深入的整合分析，有望更加全面地認(rèn)識(shí)胚胎干細(xì)胞多能性維持的分子機(jī)制，為更好地利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

表2 舉例3種分類(lèi)列別中多能性轉(zhuǎn)錄因子的基本信息