陳晨 江舟 程敏 曹麗萍 周剛 王正榮四川省科學(xué)城醫(yī)院（四川綿陽6900）；四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室（成都 6004）；衛(wèi)生部時間生物學(xué)重點(diǎn)實驗室（成都 6004）

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)近年隨著我國人民生活水平的不斷提高，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)病率逐年升高，成為嚴(yán)重危害人類健康的常見病。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleo?tide polymorphism，SNP）是指在基因組水平上單個核苷酸的變異所導(dǎo)致的一種DNA序列多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)AMI的發(fā)生發(fā)展過程與易感基因的SNP密切相關(guān)［1-2］。通過病例-對照的突變分析，搞清這類SNP與異常表型之間的關(guān)系，進(jìn)而闡明AMI的遺傳機(jī)制。近年的研究表明，近日節(jié)律鐘基因多態(tài)性確實與許多疾病的發(fā)病存在某些關(guān)聯(lián)。通過回顧國內(nèi)外的研究，筆者發(fā)現(xiàn)以下節(jié)律基因的SNP位點(diǎn)與眾多軀體疾病密切相關(guān)。例如：clock、clif及npas2等都存在SNP位點(diǎn)與睡眠相位波動、孤獨(dú)、季節(jié)性情感障礙、雙向抑郁等疾病發(fā)生相關(guān)［3-5］；bmal1與clock還與不孕不育有關(guān)聯(lián)［6］；period1、period3與海洛因、可卡因、冰毒等成癮性關(guān)系密切［7］。近日鐘基因的突變或表達(dá)異常常導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。BRAY等［8］對clock突變的小鼠心肌收縮力進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)clock基因突變后小鼠的心肌收縮力、代謝功能以及相關(guān)基因表達(dá)均發(fā)生了改變，也就是說當(dāng)clock基因突變時易導(dǎo)致小鼠發(fā)生心血管疾病。TAKEDA等［9］采用基因芯片檢測技術(shù)對血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)鐘控基因進(jìn)行了分析檢測，他們發(fā)表有229個基因其內(nèi)CLOCK/BMAL2上調(diào)，其中TM（凝血調(diào)節(jié)蛋白）也是受CLOCK/BMAL2調(diào)控的鐘控基因。為進(jìn)一步明確近日鐘基因在心肌缺血發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，本課題致力于節(jié)律基因Clif SNP與漢族人群AMI的關(guān)聯(lián)分析。筆者擬對AMI患者Clif基因多態(tài)性進(jìn)行多位點(diǎn)研究，為臨床AMI的防治提供更多實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集我院心內(nèi)科2014年6月至2016年1月確診的漢族急性心肌梗死患者120例作為病例組，年齡為38～84歲；并采集同期體檢中心的78例漢族健康人群作為對照組，年齡32～77歲。分別于清晨7：00時抽取5 mL抗凝血液進(jìn)行生化指標(biāo)檢測包括三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指標(biāo)，其中3 mL留作DNA分離進(jìn)行基因測定。所有實驗標(biāo)本的收集均經(jīng)本醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會認(rèn)可并獲得患者知情同意。

1.2 實驗儀器 普通PCR儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO?RAD公司，NanoDrop 2000c紫外分光光度計購自美國ThermoScientific公司，普通離心機(jī)及電熱恒溫水浴箱購自北京永光明醫(yī)療儀器廠，熒光定量PCR儀購自美國羅氏公司。

1.3 實驗試劑 總RNA抽提試劑Trizol購自美國Invitrogen公司。人全基因組DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（SMART?MMLV Reverse Transcrip?tase），熒光定量 PCR試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTMII kit）均購自日本Takara公司。SNaPshot試劑盒購自美國ABI公司。Pai?1（血漿纖溶酶原激活抑制物?1）和血栓素（thrombomodulin，Tm）酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自美國Sigma公司。節(jié)律基因 Clif（aryl hydrocarbon receptor nuclear transloca?tor like 2）慢病毒干擾試劑盒購自中國上海吉瑪公司。PCR擴(kuò)增引物由上海生工公司合成。

1.4 DNA的提取 選取采集的新鮮血細(xì)胞，按照人全基因組DNA提取試劑盒說明書，提取各標(biāo)本中的全基因組DNA。隨后將DNA使用NanoDrop 2000c紫外分光光度計測定所提取每個樣本的全基因組濃度，并放于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單堿基引物延伸法基因分型（SnapShot） 按照SnapShot試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物總體積 9 μL，Exol酶 0.1 μL，SAP buffer 0.1 μL，SAP 2 μL，加滅菌水至總體積12 μL。反應(yīng)條件：37℃1 h；75℃15 min。隨后進(jìn)行單堿基引物延伸，反應(yīng)體系：純化后產(chǎn)物1 μL，SNapShot Multi?plex 1 μL，SnapShot primer 0.2 μL，加滅菌水至總體積5 μL。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性1 min；96℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s，共25個循環(huán)。隨后采用1%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物大小，取出凝膠在凝膠成像系統(tǒng)記錄并鑒定提取結(jié)果。

1.6 RNA干擾技術(shù) C57BL/6J小鼠購自南京動物模式研究，動物實驗經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。參照Clif基因慢病毒干擾試劑盒，采用小鼠尾靜脈注射干擾物，沉默小鼠Clif基因的表達(dá)，并采用熒光定量PCR測定小鼠血漿Clif mRNA的表達(dá)水平變化。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 采用雙抗體夾心法測定慢病毒干擾前后小鼠血漿中PAI?1和血栓素（TM）蛋白含量的變化表達(dá)水平。主要原理如下：用純化的一抗包被微孔板，制成固相抗體，往微孔中加入血清，再加入與酶標(biāo)記過的二抗結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加顯色劑顯色。

1.8 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng) 收集各組小鼠的血漿，按照Trizol試劑盒說明書抽提標(biāo)本總RNA。用NanoDrop 2000c紫外分光光度計對提取的總RNA進(jìn)行定量后，取1 μg總RNA按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcription，RT）合成cDNA，隨后將cDNA放置-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡkit試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：SYBR?Pre?mix Ex TaqTMⅡMix 10 μL，正、反向引物（10 μmol）共2.0 μL，cDNA 1 μL，滅菌水7 μL，引物序列見表1。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火+延伸30 s，共40個循環(huán)，4℃冷卻30 min，反應(yīng)結(jié)束后置4℃保存。以Gapdh為內(nèi)參，采用2－△△CT方法［10］分析各基因相對表達(dá)量。

表1 基因引物序列信息Tab.1 Sequence information of gene primers

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Statistical Program for Social Science 18.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用t檢驗?；蛐秃偷任换蝾l率分析采用基因計數(shù)法計算，研究對象與Hardy Weinberg平衡的符合程度、單個基因型及組間等位基因頻率比較采用四格表卡方檢驗，以95%可信區(qū)間（CI）表示相對風(fēng)險度。以P＜0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 觀察組與對照組臨床資料統(tǒng)計結(jié)果見表2。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，兩組人群性別和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而觀察組總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白指標(biāo)明顯高于對照組，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示上述3項指標(biāo)與AMI發(fā)生密切相關(guān)。

表2 觀察組與對照組臨床資料統(tǒng)計比較Tab.2 Statistical comparison of clinical data between the experimental group and the control group ±s

表2 觀察組與對照組臨床資料統(tǒng)計比較Tab.2 Statistical comparison of clinical data between the experimental group and the control group ±s

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別觀察組對照組P值例數(shù)120 78年齡（歲）46.3±5.6 48.4±6.8 0.72性別（女/男）45/75 31/47 0.89 HDL?C（mmol/L）1.91±0.85 1.36±0.31 0.17 TC（mmol/L）4.49±1.03 2.84±0.76 0.005*TG（mmol/L）1.92±1.56 1.23±0.66 0.002*LDL?C（mmol/L）3.75±0.88 2.78±0.63＜0.001*

2.2 Clif基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布在觀察組與對照組中的比較 通過Hardy?Weinberg遺傳平衡對全部數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗，結(jié)果表明樣本選擇達(dá)到了Hardy?Weinberg遺傳平衡，表明本實驗選擇的樣本具有代表性。觀察組與對照組中Clif基因的基因型頻率分布情況及其統(tǒng)計分析見表3。結(jié)果表明，Clif基因rs2289709位點(diǎn)的基因型頻率分布在實驗組與對照組中差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而rs62758860位點(diǎn)基因型頻率分布在觀察組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 Clif基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率分布在觀察組與對照組中的比較 觀察組與對照組中Clif基因的等位基因頻率分布情況及其統(tǒng)計分析見表4。結(jié)果表明，Clif基因rs2289709位點(diǎn)的等位基因頻率分布在實驗組與對照組中差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而rs62758860位點(diǎn)等位基因頻率分布在觀察組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

2.4 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿中Clif、Pai?1和Tm基因mRNA表達(dá)變化 采用小鼠尾靜脈注射干擾物，沉默小鼠Clif基因的表達(dá)，并采用熒光定量PCR測定上述基因mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果見圖1，以對照組小鼠血漿Clif的表達(dá)量為1，則慢病毒轉(zhuǎn)染組Clif的表達(dá)量為0.17±0.08；以對照組小鼠血漿PAI?1的表達(dá)量為1，則慢病毒轉(zhuǎn)染組PAI?1的表達(dá)量為0.39±0.12；以對照組小鼠血漿TM的表達(dá)量為1，則慢病毒轉(zhuǎn)染組TM的表達(dá)量為0.56±0.15。上述結(jié)果表明小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，Clif、PAI?1和TM基因表達(dá)水平均較對照組顯著下降（P＜0.05）。

表3 Clif基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布在實驗組與對照組中的比較Tab.3 Comparison of genotype frequency distribution of Clif gene polymorphic loci in experimental group and control group

表4 Clif基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率分布在觀察組與對照組中的比較Tab.4 Comparison of allele frequency distribution of Clif gene polymorphism in experimental group and control group

圖1 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿中Clif、Pai?1和Tm基因mRNA表達(dá)變化Fig.1 Changes of mRNA expression of Clif，Pai?1 and Tm genes in plasma after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice

2.5 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿中蛋白PAI?1和TM水平表達(dá)變化 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測小鼠血漿中PAI?1和TM蛋白水平，結(jié)果見表5。分析發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，其血漿PAI?1和TM蛋白水平均較對照組小鼠顯著降低（P＜0.05）。

表5 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿蛋白PAI?1和TM水平表達(dá)變化Tab.5 Changes in plasma protein PAI?1 and TM levels after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice±s

表5 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿蛋白PAI?1和TM水平表達(dá)變化Tab.5 Changes in plasma protein PAI?1 and TM levels after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice±s

組別慢病毒轉(zhuǎn)染組對照組P值例數(shù)11 11 PAI?1 41.10±7.32 48.09±12.13 0.045 TM 17.47±3.35 22.58±4.96 0.047

3 討論

流行病學(xué)及時間生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死大部分發(fā)生于早晨，表明近日節(jié)律對心肌梗死的發(fā)生有重要的影響。已經(jīng)報道的節(jié)律基因，如Bmal1與高血壓發(fā)病密切相關(guān)［11-12］。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)表現(xiàn)出典型的近日節(jié)律振蕩，腎素-血管緊張素系統(tǒng)在早晨功能表達(dá)升高。腎素-血管緊張素系統(tǒng)與血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮的近日節(jié)律性有關(guān)聯(lián)。近日節(jié)律基因mPer2，dbp和Bmal1在鼠主動脈表現(xiàn)出明顯的近日節(jié)律振蕩，予以血管緊張素II會發(fā)現(xiàn)上述基因的表達(dá)增加［13-14］。另外，還有報道指出在急性心肌梗死動物心臟中mPer2，dbp，Bmal1和CLOCK基因表達(dá)水平明顯升高［15］。通常情況下，心血管系統(tǒng)的近日節(jié)律變化的規(guī)律可反映出心血管系統(tǒng)正常與否。

本課題通過對節(jié)律基因Clif單核苷酸多態(tài)性與漢族人群AMI的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)漢族人AMI患者的Clif基因rs2289709位點(diǎn)的基因型分布頻率與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Clif基因rs2289709位點(diǎn)與AMI存在密切關(guān)聯(lián)。PAI?1是一種單鏈糖蛋白，當(dāng)其以活性狀態(tài)存在于血漿中時與血漿波基結(jié)合素結(jié)合，形成復(fù)合物提高其穩(wěn)定性，當(dāng)PAI?1活性存在時能有效的發(fā)揮其生理機(jī)能，降低血液的凝血傾向及血栓形成，防止血液在血管內(nèi)形成血栓［16-17］。TM是位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的糖蛋白，它具有清除凝血酶、活化血液中抗凝因子蛋白C的作用，在抗凝因子蛋白C等的協(xié)同作用下能促進(jìn)纖維蛋白的溶解從而降低血栓形成等作用［9，18］。PAI?1 和TM 是在凝血機(jī)制和血栓形成中發(fā)揮著重要作用的因子，當(dāng)PAI?1和TM二者的功能失調(diào)時，將導(dǎo)致血凝和抗血栓功能失調(diào)，特別是PAI?1和TM的基因表達(dá)下調(diào)時，引起表達(dá)產(chǎn)生的PAI?1和TM減少，會造成抗凝血功能減弱，在血管中易形成血栓。

鐘控基因產(chǎn)物之一PAI?1（血漿纖溶蛋白溶酶原激活抑制因子?1）在正常情況下表現(xiàn)出近日節(jié)律。OHKURA等［19］對近日鐘基因突變小鼠的凝血和纖溶活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)未突變小鼠在21：00纖溶活性最低；而在Clock突變小鼠中纖溶活性一直很低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)clock基因突變小鼠的PAI?1的近日節(jié)律消失；上述研究結(jié)果表明clock基因在調(diào)控PAI?1從而影響纖溶系統(tǒng)，進(jìn)而使影響凝血系統(tǒng)扮演著重要的角色?；谏鲜鼋Y(jié)論，我們推測節(jié)律基因Clif對PAI?1同樣具有調(diào)控作用。為此，本課題的深入研究通過小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，觀察干擾前后小鼠血漿中Clif、Pai?1和Tm基因mRNA表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，其血漿PAI?1和TM蛋白水平均較對照組小鼠顯著降低。上述結(jié)果提示血漿PAI?1和TM亦受節(jié)律基因Clif的調(diào)控，Clif基因遺傳變異可引起PAI?1和TM等鐘控基因的節(jié)律消失，并造成血管中的血液易形成血栓。綜上所述，本研究通過對節(jié)律基因Clif單核苷酸多態(tài)性與漢族人群AMI的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)漢族人群中Clif基因rs2289709位點(diǎn)位點(diǎn)多態(tài)性與AMI存在明顯關(guān)聯(lián)。Clif基因表達(dá)下調(diào)將導(dǎo)致PAI?1和TM基因表達(dá)下調(diào)，從而引起血漿中PAI?1和TM水平下降，使血液易凝血而形成血栓。本研究結(jié)果也為闡釋AMI常發(fā)生于清晨這一近日節(jié)律的現(xiàn)象提供了重要的實驗依據(jù)。

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