劉文博 熊興龍 楊劍 禹文峰 歐煒 呂潔

貴州醫(yī)科大學(xué)1麻醉學(xué)院，2分子生物學(xué)教研室（貴陽 550004）

全身麻醉由于各種因素對體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)影響，導(dǎo)致患者外周血管擴張和中心體溫下降發(fā)生低體溫，是圍術(shù)期最常見的并發(fā)癥之一。有文獻報道，50%～70%的手術(shù)患者出現(xiàn)低體溫，在實施外科手術(shù)的患者中，小兒更易發(fā)生低體溫。圍術(shù)期意外的低體溫將給機體帶來不良后果，尤其是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不利影響不能忽視：長時間的冷暴露可以引起大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷［1］，并可能導(dǎo)致海馬區(qū)域的功能損害［2］。機體受到寒冷損傷時可由氧化損傷導(dǎo)致其進一步發(fā)展：誘導(dǎo)腦水腫，繼發(fā)損傷及細胞凋亡［3］；國外曾有文獻報道低溫可能誘導(dǎo)細胞凋亡［4］，國內(nèi)也有中低溫體外循環(huán)可誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的報道。然而目前國內(nèi)外并無低體溫是否造成發(fā)育高峰期海馬凋亡并引起遠期記憶障礙的相關(guān)研究，因此本研究選取7 d齡新生大鼠，建立全麻誘導(dǎo)的低體溫模型，通過動物行為學(xué)測試并檢測海馬組織凋亡率，擬探討麻醉期間低體溫狀態(tài)對發(fā)育期大鼠遠期學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織凋亡率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 7日齡SD新生大鼠（貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）；丙泊酚（批號：16KK5643，北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司）；DMEM（HyClone公司）；胎牛血清（BI公司）；AnexinFITC/PI雙染試劑盒（BD公司）；流式細胞儀（BECTON DICKLNSON公司）；

1.2 方法

1.2.1 動物及分組 出生7 d的SD新生大鼠40只，12～16 g，雌雄各半，按隨機數(shù)字表法分為四組（n=10）：對照組（C組）、麻醉保溫組（A組）、麻醉低溫組（AH組）、物理低溫組（H組）。C組腹腔注射0.1 mL生理鹽水并配備加熱墊保持直腸溫度在38～39℃；A組以25 mg/kg腹腔注射異丙酚0.1 mL，每20 min追加初始劑量的一半，麻醉2 h，同方法保持直腸溫度在38～39℃；AH組麻醉方式及時間與A組相同，大鼠在麻醉過程中不保溫，控制室溫條件為23℃，允許體溫自然地下降；H組大鼠腹腔注射0.1 mL生理鹽水，物理降溫方式與AH組相同。麻醉過程中持續(xù)吸氧，觀察大鼠呼吸、皮膚顏色，大鼠腹部固定帶狀嬰兒脈搏血氧飽和度探頭，持續(xù)監(jiān)測SpO2（并維持SpO2在95%～99%），從麻醉開始即刻至麻醉結(jié)束時，每20 min記錄一次，標(biāo)記時間點為T0～T6，防止大鼠腦缺氧。間斷監(jiān)測大鼠體溫變化，每20 min記錄1次，標(biāo)記時間點為T0～T6。

1.2.2 行為學(xué)測試 每組隨機選取5只大鼠飼養(yǎng)至30 d采用Morris水迷宮檢測實驗動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮測試程序主要包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分，歷時6 d。根據(jù)池壁上標(biāo)記的四個入水點，將水池分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個象限，第Ⅳ象限處存在隱匿平臺。行定位航行實驗時，大鼠每天分別從各象限入水點處入水，由圖像采集及處理系統(tǒng)記錄小鼠航行軌跡，令實驗動物在水迷宮內(nèi)自由游泳2 min尋找隱匿平臺（1.5 cm），并記錄找到平臺所需時間（逃避潛伏期），若120 s內(nèi)未找到平臺記錄為120 s，實驗連續(xù)進行5 d，每天訓(xùn)練4次。第6天行空間探索實驗，拆掉水下平臺，同樣令動物自由游泳2 min，記錄2 min內(nèi)穿越平臺次數(shù)及原平臺象限逗留時間。測試過程中保持實驗室內(nèi)燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，水溫保持在（25.0±1.0）℃，以排除干擾因素。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測海馬組織凋亡率 分別于大鼠麻醉清醒后即刻和Morris水迷宮測試結(jié)束時，每組隨機選取5只大鼠處死，于冰上斷頭取大腦海馬組織。置于冰凍PBS中，剪碎，清洗3次。將處理后的組織移入15 mL離心管中，加入0.25%胰酶1 mL，置于37℃恒溫水浴箱中消化30 min。加入DMEM（含10%胎牛血清）1 mL終止消化。經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾后，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄上清加入PBS 2 mL搖勻，再次同樣轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清加入PBS 1 mL搖勻。將制備好的單細胞懸液濃度調(diào)整為1×106個/mL，取1 mL細胞，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入400 mL 1×Binding Buffer液中，加入5 mL Annexin V?FITC 和 5 mL Propidium Iodide，混勻，避光孵育15 min。1 h內(nèi)上機檢測，所用試劑盒為Anexin?FITC/PI雙染試劑盒，流式細胞儀為美國BECTON DICKLNSON公司生產(chǎn)。所得數(shù)據(jù)采用Flowjo 10進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，不同時點比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 四組大鼠SpO2均在正常范圍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。麻醉期間，分別與C、A組比較，AH、H組大鼠體溫明顯下降（P＜0.05）（圖1）。

表1 4組大鼠SpO2比較Tab.1 Comparison of SpO2in 4 groups（n=10）±s，%

表1 4組大鼠SpO2比較Tab.1 Comparison of SpO2in 4 groups（n=10）±s，%

組別C組A組AH組H組T0 96.2±1.4 95.8±2.5 96.4±2.7 96.0±2.1 T1 96.2±1.3 94.2±1.9 95.0±1.8 96.2±1.6 T2 97.2±1.3 96.4±0.8 96.6±1.8 96.6±2.0 T3 95.8±1.0 96.2±1.3 95.8±1.0 96.0±2.4 T4 97.0±2.1 96.0±1.5 95.8±2.2 97.4±1.8 T5 97.0±0.7 96.0±1.2 95.4±1.5 97.0±2.0 T6 97.2±1.0 96.8±1.3 97.6±1.1 96.8±0.8

圖1 四組大鼠體溫比較Fig.1 Comparison of temperature in 4 groups

2.2 動物行為學(xué)測試比較 各組間逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）；空間探索試驗中，四組大鼠穿越平臺次數(shù)及原平臺象限逗留時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

2.3 海馬組織凋亡率比較 由散點圖可見，凋亡率為Q2象限和Q3象限細胞數(shù)總和所占百分比。在7日齡大鼠中，分別與C、A組比較，AH、H組凋亡率增高（P＜ 0.05）（圖2）。在36日齡大鼠中，四組凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

表2 4組大鼠逃避潛伏期的比較Tab.2 Comparison of escape latency in 4 groups（n=5）±s，s

表2 4組大鼠逃避潛伏期的比較Tab.2 Comparison of escape latency in 4 groups（n=5）±s，s

分組C組A組AH組H組第1天72.3±23.1 93.7±22.2 83.8±19.7 70.8±22.1第2天46.8±23.2 49.0±21.4 44.5±18.8 43.1±24.3第3天44.6±21.6 46.4±23.3 41.2±21.8 48.0±19.6第4天23.6±13.3 22.5±10.1 26.0±10.2 22.0±7.8第5天17.4±13.5 18.8±5.8 21.0±11.2 22.9±3.5

表3 4組大鼠穿越平臺次數(shù)及原平臺象限逗留時間比較Tab.3 Comparison of the times of crossing the platform and the time of staying original platform quadrant in 4 groups（n=5）±s

表3 4組大鼠穿越平臺次數(shù)及原平臺象限逗留時間比較Tab.3 Comparison of the times of crossing the platform and the time of staying original platform quadrant in 4 groups（n=5）±s

組別C組A組AH組H組穿越平臺次數(shù)7.6±3.9 7.2±4.4 8.6±3.3 6.4±4.2原平臺象限逗留時間（s）55.4±21.5 44.4±13.3 42.6±6.6 40.7±14.3

圖2 7日齡四組大鼠凋亡率比較Fig.2 Comparison of apoptotic rate of 7?day?old rats in four groups

3 討論

圖3 36日齡四組大鼠凋亡率比較Fig.3 Comparison of apoptotic rate of 36?day?old rats in four groups

海馬體（hippocampus）位于大腦丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間，屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，其功能與學(xué)習(xí)記憶、情緒反應(yīng)等密切相關(guān)。海馬受損會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。流式細胞術(shù)工作原理是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多參數(shù)、快速的定量分析，是當(dāng)代最先進的細胞定量分析技術(shù)之一。細胞凋亡早期位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸（PS）遷移到膜外，可利用AnnexinV對PS的高度親和力將凋亡細胞標(biāo)記出來。但壞死細胞由于PS暴露于細胞外也呈An?nexinV陽性，因此需要采用PI這一參數(shù)將壞死細胞區(qū)分開來。壞死細胞PI強染色，而凋亡細胞染色較弱。AnnexinV/PI雙參數(shù)法能夠檢測早期細胞凋亡，可以正確區(qū)分凋亡和壞死，多數(shù)文獻推薦其作為流式細胞術(shù)檢測凋亡的方法［5］。因此本研究采用AnnexinV/PI雙參數(shù)法檢測低溫對海馬組織凋亡率的影響。

根據(jù)現(xiàn)有文獻［6］并結(jié)合初步實驗結(jié)果，當(dāng)丙泊酚劑量為25 mg/kg時，即可達到麻醉效果，使新生大鼠翻正反射消失，所以筆者選擇該劑量進行麻醉，持續(xù)時間為2 h。大鼠是晚成性哺乳動物，新生大鼠體溫調(diào)節(jié)能力微弱，將幼體單獨隔離后其體溫會因環(huán)境溫度的變化而變化，直至達到接近環(huán)境溫度的水平［7］。因此筆者通過調(diào)控實驗室環(huán)境溫度為23℃，在不保溫的條件下，使新生大鼠體溫隨環(huán)境溫度而下降，結(jié)合預(yù)實驗并參照WHITTINGTON等［8］的研究，將體溫最低降至25℃左右。

由研究結(jié)果可以看出：7 d齡大鼠中，處于低體溫狀態(tài)的兩組海馬組織凋亡率均明顯增高。而通過對體溫相近的兩組間比較，發(fā)現(xiàn)海馬組織凋亡率含量無明顯差異，提示低體溫可能是造成凋亡率增高的主要原因。其機制可能與多種因素有關(guān)，已有文獻報道在寒冷應(yīng)激狀態(tài)下Akt（蛋白激酶B）?ERK信號通路表達下調(diào)［9］，Akt及ERK與細胞的凋亡有著密切的關(guān)系，其下調(diào)可能是參與導(dǎo)致凋亡率增高的原因之一［10］。在低體溫條件下，由于大鼠海馬ATP含量下降，受其調(diào)控的cAMP/PKA通路表達的下調(diào)同樣可誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。低溫可降低神經(jīng)細胞間廣泛存在的縫隙連接通訊功能，影響了營養(yǎng)物質(zhì)在細胞間的傳遞，因此，同樣也可造成神經(jīng)組織的損害［11］。低溫也可誘導(dǎo)海馬組織中Tau蛋白過度磷酸化，產(chǎn)生細胞毒性并介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［12］。另有研究表明麻醉期間低體溫可引起大鼠神經(jīng)細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，降低腦內(nèi)胰島素對凋亡的抑制作用［13-14］。低體溫狀態(tài)下凋亡率增高可能還與冷環(huán)境刺激引起細胞內(nèi)Bax蛋白相關(guān)基因表達高于Bcl?2相關(guān)基因表達有關(guān)［15］。

為了測試低體溫是否對各組間的遠期學(xué)習(xí)記憶能力同樣造成影響，我們采用Morris水迷宮測試大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，并同樣檢測海馬組織凋亡率。結(jié)果表明在36日齡大鼠水迷宮測試結(jié)束時，各組行為學(xué)測試結(jié)果及海馬組織凋亡率均無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是由于短時間內(nèi)低體溫對神經(jīng)系統(tǒng)的損害是可逆的，其造成的影響會隨體溫的恢復(fù)而逐漸消失，國外亦有與本研究結(jié)果一致的報道［16］。

綜上所述，在本研究低體溫范圍內(nèi)，麻醉期間體溫降至25℃時可短期誘導(dǎo)新生大鼠海馬組織凋亡率增高，而對其遠期學(xué)習(xí)記憶能力無明顯影響。本研究為嬰幼兒臨床麻醉中需要注意加強保溫措施，以預(yù)防低體溫造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，提供了一定的實驗參考數(shù)據(jù)。但本實驗未進一步研究其分子機制且樣本量較少，以及由于本實驗中低溫處理的時間略短而未能體現(xiàn)低體溫造成的遠期危害，這些都是本研究的不足之處。為進一步完善本研究，后續(xù)筆者將針對麻醉期間低體溫大鼠進行凋亡相關(guān)蛋白等機制的探討。

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