毛英 黃湖南 王建榮 桂雄建 吳冰中國人民解放軍第一八四醫(yī)院普外科（江西鷹潭335000）；贛南醫(yī)學院解剖教研室（江西贛州34000）

乳腺癌的女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其高轉移性是導致病死率高的主要原因，因此進一步探討其轉移的機制是乳腺癌治療的熱點問題［1-3］。脂肪酸轉運蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）是一類將脂肪酸轉運到各種細胞間的脂肪素，是脂肪代謝的重要調(diào)節(jié)因子，研究還發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)基因的表達、細胞的增殖分化等［4-5］。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4是促進宮頸癌［6］、肝癌［7］等細胞增殖、轉移的重要因素。新近的研究也發(fā)現(xiàn)FABP4與乳腺癌的增殖密切相關［8］，但其在乳腺癌轉移中的具體作用和機制鮮有報道。因此本研究進一步探討在乳腺癌轉移中的作用和機制，為乳腺癌的診治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 Transwell小室（Corning公司，美國），F(xiàn)ABP4兔來源多克隆一抗（Abcam公司，美國），β?actin鼠來源單克隆一抗（CST公司，美國），抗兔或鼠HRP標記二抗（中杉金橋，北京），高糖型DMEM、胎牛血清（Gibco公司，美國），胰蛋白酶（吉諾公司，中國），新霉素和嘌呤霉素（sigma，美國），IL?33中和抗體（R&D Systems，美國）。

1.2 細胞培養(yǎng) 乳腺癌細胞ZR?75?30，BT?474，T?470，MCF?7，BT549和MDA?MB?231 由本院實驗室保存細胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.3 免疫組化 收集我院2015年1月至2017年12月乳腺癌患者手術標本的病理石蠟切片，其中未轉移癌28例、轉移癌41例。石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復、5%羊血清封閉、FABP4一抗（1∶200）4℃孵育過夜，HRP標記兔二抗室溫1 h，DAB顯色。染色評分參考MENG等［9］的方法。

1.4 干擾RNA（shRNA）轉染 shRNA由上海吉瑪生物公司合成，系列參考TANG等［10］的報道。MDA?MB?231細胞轉染按lip?2000的說明書進行。轉染48 h，與新霉素0.2 μg/mL篩選，直至熒光顯微鏡下95%以上的細胞有熒光，Western blot檢測蛋白水平。

1.5 慢病毒過表達 過表達FABP4蛋白的慢病毒由上海和元生物公司合成。按慢病毒滴度和細胞比1∶50進行轉染MCF?7細胞，48 h后給予嘌呤霉素（20 ng/mL）篩選，直至熒光顯微鏡下95%以上的細胞有熒光，Western blot檢測蛋白水平。

1.6 Western blot 提取全細胞蛋白，加入load?ing buffer后蛋白變性。SDS?PAGE膠分離蛋白（80 V，0.5 h后換100 V，1 h），轉膜（冰浴，90 V，1.5 h）。封閉（5% 脫脂奶粉，室溫，2 h），5%BSA稀釋FABP4、β?actin一抗（1∶1 000）4℃過夜孵育。二抗（1∶5 000）常溫1 h，TBST 洗膜后ECL顯影。

1.7 ELISA IL?33檢測參照eBioscience公司（美國）ELISA試劑盒說明進行。

1.8 Transwell 50 mg/L Matrigel 1∶5稀釋液，50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。細胞消化后用無血清培養(yǎng)基DMEM制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL。吸取200 μL細胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清的DMEM 600 μL。18 h后取出小室，去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min后，結晶紫染色2 h，顯微鏡下拍照。

1.9 裸鼠轉移實驗 40只雌性BALC/c裸鼠購置南方醫(yī)科大學動物實驗心中，參照南方醫(yī)科大學動物實驗的要求，飼養(yǎng)我院SPF級動物房。20只雌性BALC/c裸鼠，5 × 106個MDA?MB?231鼠尾靜脈注射，隨機分為兩組，腹腔注射人源IL?33中和抗體（IL?33 nAb）10只及腹腔注射controlIgG（CtrlAb）10只。20只雌性BALC/c裸鼠，5 × 106個過表達FABP4的MCF?7細胞鼠尾靜脈注射，隨機分為兩組，腹腔注射人源IL?33中和抗體（IL?33 nAb）10只及腹腔注射control IgG（Ctrl Ab）10只。42 d后收集肺組織，石蠟包埋切片HE染色后，觀察每個肺葉切片的癌轉移結節(jié)。

1.10 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件，采用One?way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法進行方差齊性檢驗，確定方差齊性且整體比較組間差異有統(tǒng)計學意義后進一步作多重比較，多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FABP4在乳腺癌中的表達水平 筆者首先檢測了乳腺癌患者手術標本石蠟切片中FABP4表達的水平，結果顯示與未轉移癌標本相比，發(fā)生轉移的乳腺癌組織中FABP4表達顯著增加（圖1A）。同時，在高轉移性的乳腺癌細胞ZR?75?30，BT549和MDA?MB?231胞漿蛋白和細胞培養(yǎng)基上清中FABP4表達都較低轉移的乳腺癌細胞BT?474，T?470和MCF?7的高（圖1B和C）。由此提示，高表達的FABP4與乳腺癌的轉移相關。

2.2 FABP4對乳腺癌轉移的影響 通過transwell實驗，筆者發(fā)現(xiàn)使用敲低高轉移性的MDA?MB?231細胞FABP4表達后，其轉移能力被明顯抑制（圖2A和B）；在低轉移的MCF?7細胞中加入過表達FABP4后，其轉移能力明顯增強（圖2C和D）。由此可見，F(xiàn)ABP4可以促進乳腺癌的轉移。

2.3 FABP4對乳腺癌細胞IL?33表達的影響 高轉移的乳腺癌細胞 ZR?75?30，BT549和MDA?MB?231細胞培養(yǎng)基上清中IL?33表達都較低轉移的乳腺癌細胞BT?474，T?470和MCF?7的顯著增多（圖3A）。敲低FABP4的MDA?MB?231細胞，其IL?33分泌明顯減少（圖3B）；而在過表達FABP4的MCD?7培養(yǎng)基上清中，IL?33顯著減少（圖3C）。由此可見，F(xiàn)ABP4可以促進IL?33的合成分泌。

2.4 IL?33在FABP4促進乳腺癌轉移中的作用 首先用IL?33中和抗體阻斷高轉移的MDA?MB?231細胞分泌的IL?33，發(fā)現(xiàn)其轉移能力被明顯抑制（圖4A和C）；同時，筆者也觀察到在過表達FABP4的MCF?7細胞其轉移能力也能被IL?33中和抗體抑制（圖4B和D）。由此提示：FABP4可能是通過增加乳腺癌細胞分泌IL?33進而促進乳腺癌轉移。

圖1 FABP4在乳腺癌中的表達水平Fig.1 The expression of FABP4 in breast cancer

圖2 FABP4對乳腺癌轉移的影響Fig.2 The effect of FABP4 on breast cancer metastasis

圖3 FABP4對乳腺癌細胞IL?33表達的影響Fig.3 The effect of FABP4 on IL?33 expression of breast cancer cells

圖4 IL?33在FABP4促進乳腺癌轉移中的作用Fig.4 The effect of IL?33 on FABP4 induced breast cancer metastasis

3 討論

FABP4是一類重要的脂類伴侶，在脂質(zhì)介導的細胞生理過程和代謝中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4非小細胞肺癌［11］、胰腺導管癌［12］等的疾病進展有非常密切的關系；進一步的也發(fā)現(xiàn)FABP4可通過促進EMT等促進腫瘤細胞的侵襲［6］。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4可以促進乳腺癌細胞的增殖；但體外實驗中，運用重組的FABP4未發(fā)現(xiàn)其可以顯著促進乳腺細胞遷移［8］。但在本研究中，通過對比臨床患者手術標本發(fā)現(xiàn)，發(fā)生轉移的患者乳腺癌組織中FABP4表達較未發(fā)生轉移的顯著增多；高轉移的乳腺癌細胞中FAPB4表達和分泌都較低轉移的多；進一步，在敲低高轉移能力的MDA?MB?231的FAPB4表達，可以抑制其侵襲轉移；而在低轉移能力的MCF?7細胞過表達FAPB4，可促進其侵襲轉移。

為什么有如此的差異呢？對比XIE等［6］宮頸癌中的研究，MASANA等使用的eFAPB4只有100 ng/mL，而XIE等在100 ng/mL也未發(fā)現(xiàn)其有促進宮頸癌細胞的轉移，在500 ng/mL中的作用非常明顯。結合本研究結果，認為FABP4有促進乳腺癌轉移的作用。

腫瘤相關炎癥反應在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要的作用，現(xiàn)有研究已經(jīng)表明腫瘤組織周圍的炎癥因子如IL?1、IL?6、CXCL9等可以促進腫瘤的增殖和轉移［13］。IL?33是一類IL?1家族細胞因子，其與炎癥反應［14］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?5］、纖維化［15］和腫瘤［17］等都有密切的關系。在乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn) IL?33 可以促進乳腺癌的增殖［18］、EMT［19］、腫瘤耐藥［20］等。筆者也觀察到在高轉移能力的乳腺癌細胞中IL?33表達顯著增高。并且，敲低FABP4表達后，MDA?MB?231細胞分泌IL?33減少；而過表達FABP4的MCF?7細胞，IL?33分泌增加。也有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4 有調(diào)節(jié)炎癥反應的作用［10，21］。由此可見，F(xiàn)ABP4可以調(diào)控腫瘤細胞IL?33的分泌。那么，F(xiàn)ABP4是否通過IL?33來調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的侵襲轉移？使用IL?33中和抗體后，F(xiàn)ABP4促進乳腺癌侵襲轉移的能力被顯著抑制。

綜上所述，筆者認為FABP4可以促進乳腺癌侵襲轉移，其機制與調(diào)控IL?33的表達有關。這可以為乳腺癌的防治提供新的靶點。但FABP4是如何調(diào)控IL?33表達分泌的還需要進一步探討。

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