王麗芳

（呂梁學(xué)院 化學(xué)系，山西 呂梁 033000）

芘丁酸（pyrenebutyric acid，PBA）具有較強的熒光強度，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，極性小，制成敏感膜后不易向水中泄漏。因此是制備光纖化學(xué)傳感器的一種理想分子探針[1]。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，以芘丁酸為分子探針的光纖化學(xué)傳感器可用于片劑和膠囊的體外溶出度監(jiān)測及清醒動物尿藥和腦脊液藥物濃度的監(jiān)測[2]。芘丁酸還可以用來合成熒光化學(xué)敏感器，應(yīng)用于超分子化學(xué)領(lǐng)域的分子識別[3]。研究芘丁酸與牛血清白蛋白（BSA）間作用可獲取其在體內(nèi)被轉(zhuǎn)運、分配和代謝過程的重要信息，在蛋白質(zhì)檢驗、藥物藥理和毒理研究、污染毒物的危害機理及基因變異研究等方面具有重要意義。

本文通過熒光光譜技術(shù)，研究芘丁酸與牛血清白蛋白（BSA）間的相互作用。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

牛血清白蛋白（生化試劑，中國科學(xué)院生物化學(xué)研究所）；芘丁酸（Sigma公司）；三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，氫氧化鈉等均為分析純；二次蒸餾水；HITACHI 850型熒光分光光度計，HP8453 UV-Vis吸收光譜儀，Beckman酸度計，F(xiàn)innpipette加樣器。

1.2 實驗方法

1.2.1 儲備液的配制

配制 0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（內(nèi)含0.15 mol·L-1NaCl，pH 7.4），然后，用該溶液配制BSA溶液。BSA的濃度通過測定278 nm處的吸光度確定（ε = 43, 000 cm-1·mol-1·L）[4]。

1.2.2 熒光光譜的測定

移取2 mL BSA于1 cm石英池中，用可調(diào)式移液器逐次加入芘丁酸（PBA）水溶液進行熒光滴定，每次加入溶液后混合均勻，以 290 nm為激發(fā)波長，在HITACHI 850 型熒光分光光度計上記錄310～580 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。文中所用熒光強度均為考慮稀釋效應(yīng)后的值。

1.2.3 吸收光譜的測定

吸收光譜在 HP8453 UV-Vis吸收光譜儀上使用1 cm吸收池測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 芘丁酸對BSA熒光猝滅的機理

圖1 PBA對BSA熒光光譜的影響

圖1中a為BSA的熒光發(fā)射譜。由a線可見，BSA在343 nm處出現(xiàn)最大熒光峰，說明BSA的熒光是Trp殘基的熒光峰[5]。用PBA溶液滴定BSA，其343 nm處的熒光峰被逐漸猝滅，同時在377 nm及395nm處又出現(xiàn)新的發(fā)射峰，且在370 nm處存在一個等發(fā)射點，如圖1中b-h所示。PBA的加入使BSA的熒光被有規(guī)律地猝滅，其發(fā)射峰位置不變。說明二者發(fā)生了相互作用，PBA的加入對BSA分子的構(gòu)象沒有明顯影響。

熒光猝滅過程通常可以分為兩種：一種是動態(tài)猝滅，另一種是靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程[6]：

圖2 η = log[(F0-F)/F]與 log[PBA]的關(guān)系圖

對于靜態(tài)猝滅，熒光強度與猝滅劑的關(guān)系滿足雙倒數(shù)方程[7]

對于蛋白質(zhì)與小分子的靜態(tài)猝滅，結(jié)合位點數(shù)可由熒光分子與猝滅劑的結(jié)合常數(shù)表達式推導(dǎo)求出，即：

圖2 是實驗數(shù)據(jù)按(3)式處理得到的曲線。

由圖2可見，三條曲線均呈良好的線性關(guān)系，且隨溫度升高，直線斜率減小，猝滅過程應(yīng)為靜態(tài)猝滅。

表 1是由 Stern-volmer曲線擬合得到的 Ksv和Kq數(shù)據(jù)。

表1 Stern-volmer曲線擬合得到的Ksv和Kq數(shù)據(jù)

從表1看出Ksv均大于104mol-1·L。生物大分子熒光平均壽命τ0大約為 10-8s[6]，從表中可以看出 Kq均大于1012mol-1·L，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)為 2.0×1010s-1·mol-1·L[6]。顯然，PBA 對 BSA 熒光猝滅的速率遠(yuǎn)大于擴散控制的Kq。由此可以推斷，猝滅過程為形成化合物所引起的靜態(tài)猝滅，不是由于分子碰撞所引起的動態(tài)猝滅。

2.2 芘丁酸與 BSA的結(jié)合位點數(shù) n、結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)K

由圖2線性擬合方程斜率可以得到結(jié)合位點數(shù) n，所得結(jié)果列于表 2。利用靜態(tài)猝滅的雙倒數(shù)方程(2)式處理實驗數(shù)據(jù)，計算PBA與BSA的結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)K=1/KD，結(jié)果亦列于表2。

表2 不同溫度下線性擬合方程和結(jié)合位點數(shù)n

由表2可知，PBA與BSA結(jié)合形成較穩(wěn)定的配合物，結(jié)合位點數(shù)為1，而且K值隨溫度的升高而降低，說明二者的結(jié)合穩(wěn)定性隨溫度的升高而減弱。

2.3 芘丁酸和BSA色氨酸殘基間距離

前文述及，BSA的熒光主要是來自色氨酸。根據(jù) F?rster無輻射能量轉(zhuǎn)移理論，可以計算有機小分子與色氨酸殘基之間的距離。

比較PBA的吸收光譜與BSA的熒光發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)兩者有不同程度的重疊（見圖3）。根據(jù) F?rster型偶極-偶極無輻射能量轉(zhuǎn)移機理[7]，求得光譜的重疊積分 J=1.15×10-13cm3·L?mol-1。在上述實驗條件下，參照文獻[7]，以色氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物(φ= 0.14)，測得BSA中色氨酸量子效率ΦD為0.118，取向因子取給體-受體各向隨機分布的平均值K2= 2/3，折射指數(shù)n取水和有機物平均值 1.336，求得 R0為 3.68 nm。再通過 PBA與BSA摩爾比為1：1時配合物的熒光強度，計算得到能量轉(zhuǎn)移效率E = 0.43，求得PBA距色氨酸殘基最短距離為r = 3.86 nm。

圖3 BSA的熒光光譜和PBA的吸收光譜

2.4 芘丁酸與BSA作用的熱力學(xué)性質(zhì)

小分子與蛋白質(zhì)間的作用力主要包括以下幾種類型：氫鍵、范德華力、靜電因力、疏水作用力。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)與作用力的關(guān)系，可以確定其作用力類型、當(dāng)溫度變化不大時，反應(yīng)的焓變ΔH可以看作一個常數(shù)，改變溫度，求得不同溫度下的結(jié)合常數(shù)，根據(jù)公式即可求得ΔH、ΔG、ΔS。

由 PBA與 BSA的猝滅過程所得的結(jié)合常數(shù)，求得不同溫度下的ΔH、ΔG、ΔS，列于表3。

表3 PBA與BSA結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)

Ross等認(rèn)為，在很多情況下，即使ΔH＜0，蛋白質(zhì)和一些小分子之間，主要作用力仍為疏水作用力[8]。對于實際體系中，其宏觀表現(xiàn)往往是幾種作用力同時作用的結(jié)果。因此，PBA與BSA可能主要以疏水作用力結(jié)合，同時也包括其他作用力。

3 結(jié)論

以芘丁酸滴定牛血清白蛋白，BSA的熒光被有規(guī)律的猝滅，兩者之間的作用為單一的熒光靜態(tài)猝滅過程。PBA的加入對BSA分子的構(gòu)象沒有明顯影響。二者以摩爾比 1：1結(jié)合。BSA 與PBA主要依靠疏水作用力結(jié)合形成配合物。當(dāng)在合適的激發(fā)波長掃描 BSA與芘丁酸的復(fù)合體系的熒光光譜時，它們之間能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，能量轉(zhuǎn)移給體（BSA分子中色氨酸殘基）與受體（PBA）之間的距離為3.86 nm。

[1] 陳堅,朱濱,袁立懋,等.基于熒光猝滅原理的光纖化學(xué)傳感器研究：II.比較五種分子探針制成敏感膜的動力學(xué)猝滅性質(zhì)[J].新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1993,16(4)：303-307.

[2] 陳堅,李偉,閻超,等.基于多猝滅響應(yīng)原理的 PBA 光纖化學(xué)膜傳感器的性能和應(yīng)用研究[J].中國科學(xué)(C輯),1997,27(1)：69-76.

[3] 李華平,汪鵬飛,吳世康.含芘熒光化學(xué)敏感器及其與核苷磷酸鹽的相互作用[J].中國科學(xué)(B輯)1999,29(3)：229-237.

[4] Zhang Y, Wilcox D E. Thermodynamic and spectroscopic study of Cu(II) and Ni(II) binding to bovine serum albumin[J]. J Biol Inorg Chem, 2002, (7)： 327-337.

[5] 魏永巨.蛋白質(zhì)分子吸收與散射光譜探針的研究[D].北京：北京大學(xué),1996：11-12.

[6] 劉雪鋒,夏詠梅,方云,等.三種香豆素類中藥小分子與牛血清白蛋白的相互作用[J].化學(xué)學(xué)報,2004,62(16)：1484-1490.

[7] 楊斌盛,楊頻.稀土離子與人血清白蛋白的作用[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,1988,20(5)：499-503.

[8] Philip D. Ross, S. Subramanian. Thermodynamics of protein association reactions： forces contributingto stability[J]. Biochemistry, 1981, 20(11)： 3096-3102.