其木格 董磊 張秀麗 張立忠 李艷飛 王杰

010017呼和浩特，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科（其木格、張秀麗、張立忠、李艷飛、王杰）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生院［董磊（現(xiàn)在鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院皮膚科）］

頭孢曲松是治療淋病的一線藥物，但近年來對頭孢曲松敏感性下降或耐藥的淋球菌在全球多個(gè)國家和地區(qū)出現(xiàn)［1-3］，亦有數(shù)個(gè)頭孢曲松治療咽部淋球菌感染失敗的報(bào)道［4-5］。我國目前尚無頭孢曲松耐藥相關(guān)的淋病治療失敗報(bào)道，但頭孢曲松低敏的淋球菌陽性率逐年升高［6-7］。淋球菌對頭孢菌素低敏或耐藥的分子機(jī)制涉及青霉素結(jié)合蛋白2基因（penA）、調(diào)節(jié)MtrCDE外排泵功能的基因（mtrR）、孔蛋白基因（porB/penB）、青霉素結(jié)合蛋白1基因（ponA）以及pilQ基因等在內(nèi)的多個(gè)耐藥基因決定子以及其他未知的耐藥基因，其中編碼青霉素結(jié)合蛋白2（PBP2）轉(zhuǎn)肽酶的penA基因突變起主導(dǎo)作用［8］。為進(jìn)一步探討penA和mtrR基因突變在淋球菌對頭孢曲松耐藥機(jī)制中的作用，我們通過對原代及子代耐藥淋球菌株penA和mtrR基因測序，了解靶位基因突變與菌株耐藥的關(guān)系。

一、材料與方法

1.菌株來源：所用4株淋球菌均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所性病實(shí)驗(yàn)室提供，體外次抑菌濃度誘導(dǎo)頭孢曲松耐藥過程亦在該實(shí)驗(yàn)室完成。1株為標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-49226（頭孢曲松敏感菌株），3株為臨床分離株，分別為頭孢曲松低敏菌株（2012-5616）、頭孢曲松敏感菌株（2012-4052和2012-15361）。4株菌均經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)確認(rèn)，藥物敏感性試驗(yàn)已在前期完成［9］，菌株的藥物敏感性特征見表1。

2.主要試劑：頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)粉為美國Sigma公司產(chǎn)品，淋球菌培養(yǎng)基GC基礎(chǔ)粉和增菌劑（1%IsoVitaleX）均為美國BD公司產(chǎn)品，淋球菌氧化酶、DNA提取液、PCR試劑、引物等由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，基因測序由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成。

3.體外次抑菌濃度誘導(dǎo)試驗(yàn)：將選取的4株試驗(yàn)菌株進(jìn)行頭孢曲松體外次抑菌濃度（1/2最低抑菌濃度，1/2 MIC）誘導(dǎo)，在36℃、5%CO2及80%濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h時(shí)于抗生素培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種傳代1次，待菌株生長穩(wěn)定后，連續(xù)傳代培養(yǎng)，MIC濃度依次遞增為1/2、1、2、4、8、16……直至最后1次的培養(yǎng)基上有菌落穩(wěn)定生長（MIC≥1 mg/L）。在無抗生素培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代培養(yǎng)耐藥突變菌株，研磨洗脫于20%甘油的胰酶大豆肉湯凍存培養(yǎng)基中，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4.penA和mtrR基因引物：采用Lee等［10］設(shè)計(jì)的引物，penA基因片段較長，將其分成3個(gè)片段penA-1、penA-2和penA-3，測序后再用基因軟件DNAStar進(jìn)行拼接分析。引物序列見表2。

5.penA和mtrR基因測序：提取誘導(dǎo)前原代菌株及誘導(dǎo)后子代耐藥菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系50 μl，其中緩沖液5 μl，dNTP 1 μl，正反向引物各1 μl，DNA模板1 μl，DNA聚合酶（Taq酶）0.3 μl，雙蒸水 41 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 s，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。之后將ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導(dǎo)前后的原代和子代耐藥株的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序。

表1 研究所用4株淋球菌菌株的藥物敏感性

表2 penA和mtrR基因引物序列

二、結(jié)果

1.4株耐藥淋球菌的PCR結(jié)果：ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導(dǎo)前后均有目的基因表達(dá)，penA基因分段擴(kuò)增出的陽性片段長度分別為620、580和870 bp，mtrR基因?yàn)?00 bp。見圖1。

2.體外次抑菌濃度誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果：ATCC-49226從1/2 MIC誘導(dǎo)至64 MIC產(chǎn)生耐藥共誘導(dǎo)了28代，臨床低敏菌株2012-5616誘導(dǎo)至4 MIC共傳代了26代，臨床敏感菌株2012-15361誘導(dǎo)至16 MIC共傳代了36代，臨床敏感菌株2012-4052誘導(dǎo)至16 MIC共傳代了22代。見表3。

圖 1 淋球菌株 ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361誘導(dǎo)耐藥前后penA和mtrR基因凝膠電泳圖 -：陰性對照；M：標(biāo)準(zhǔn)參照物

3.基因測序結(jié)果：

（1）penA基因測序結(jié)果：ATCC-49226誘導(dǎo)耐藥前PBP2序列為標(biāo)準(zhǔn)序列，2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導(dǎo)前后以及ATCC-49226誘導(dǎo)后耐藥菌株的PBP2序列都是ⅩⅧ序列（含A501T和G542S）；ATCC-49226誘導(dǎo)耐藥后在penA編碼區(qū)發(fā)生A501T、G542S突變，另3株菌誘導(dǎo)后penA基因均未出現(xiàn)新的突變位點(diǎn)；未檢測到penA鑲嵌狀結(jié)構(gòu)模式。penA基因測序獲得的波形圖符合標(biāo)準(zhǔn)基因測序分析的要求。見圖2。

（2）mtrR基因測序結(jié)果：2012-5616和ATCC-49226菌株在誘導(dǎo)前后均為A39T突變模式，2012-15361菌株誘導(dǎo)前后均無突變，2012-4052誘導(dǎo)后耐藥菌株在mtrR編碼區(qū)發(fā)生A39T突變。

三、討論

淋球菌對頭孢曲松耐藥涉及多個(gè)耐藥基因決定子及其相互作用，包括penA基因、mtrR基因等［8］。penA的鑲嵌狀突變模式和非鑲嵌狀penA的A501位的突變被證實(shí)與頭孢曲松的耐藥相關(guān)［11-13］。mtrR基因表達(dá)主要與淋球菌外排系統(tǒng)有關(guān)，發(fā)生突變時(shí)可以導(dǎo)致mtrCDE外排泵系統(tǒng)表達(dá)增加，使淋球菌內(nèi)部有效藥物濃度下降而引起耐藥［14］。

Unemo等［15］研究臨床分離的高度耐頭孢曲松淋球菌菌株H401，發(fā)現(xiàn)含有penA-CI鑲嵌狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)同時(shí)合并PBP2發(fā)生A501P突變，可能引起淋球菌對頭孢曲松敏感性下降。Sethi等［16］對大樣本臨床敏感淋球菌進(jìn)行MIC檢測及penA基因測序分析發(fā)現(xiàn)，所有敏感菌株未發(fā)現(xiàn)鑲嵌狀結(jié)構(gòu)及PBP2的A501突變，從而認(rèn)為鑲嵌狀結(jié)構(gòu)或PBP2的A501突變可能只發(fā)生在淋球菌對頭孢曲松低敏或耐藥的菌株。Lee等［10］對46株頭孢克肟和頭孢曲松敏感性降低的淋球菌進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)，頭孢菌素敏感性降低的大多數(shù)菌株，penA突變模式以A501V突變?yōu)橹?。Olsen等［17］對2011年越南地區(qū)收集的淋球菌進(jìn)行藥敏及耐藥基因研究顯示，78%的淋球菌PBP2的A501位氨基酸出現(xiàn)突變，其中A501V突變模式占44%，A501T突變模式占34%。還有研究發(fā)現(xiàn)，A501突變和G542S與非鑲嵌狀PBP2菌株的頭孢曲松耐藥或敏感性下降有關(guān)［18-20］。我們的研究中，頭孢曲松敏感菌株誘導(dǎo)耐藥后出現(xiàn)A501T和G542S突變，提示penA基因中的A501T和G542S突變可能在頭孢曲松耐藥中起重要作用。

Liao等［21］對淋球菌臨床敏感菌株及低敏菌株研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)mtrR基因編碼區(qū)特定位點(diǎn)突變（如A39T、G45D）和（或）啟動子區(qū)的13 bp反向重復(fù)序列的單堿基A缺失突變時(shí)，MtrR蛋白減少，引起MtrCDE外排泵系統(tǒng)過度表達(dá)，增加藥物外排，從而導(dǎo)致包括頭孢曲松在內(nèi)的抗生素敏感性下降。我們的研究中，菌株2012-5616（頭孢曲松低敏并對青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素和環(huán)丙沙星耐藥）和ATCC-49226（頭孢曲松和環(huán)丙沙星敏感，但對青霉素、四環(huán)素和阿奇霉素低敏）在誘導(dǎo)前已出現(xiàn)A39T突變；而菌株2012-4052（頭孢曲松敏感，對四環(huán)素和環(huán)丙沙星耐藥，對青霉素和阿奇霉素低敏）只在誘導(dǎo)耐藥后在mtrR編碼區(qū)發(fā)生A39T突變。這些結(jié)果提示，在mtrR編碼區(qū)發(fā)生A39T突變可能在頭孢曲松耐藥中發(fā)揮作用，另外，mtrR基因可能與多重耐藥相關(guān)。

表3 4株淋球菌誘導(dǎo)耐藥前后頭孢曲松最低抑菌濃度（MIC）變化情況

圖2 penA基因片段測序波形圖

本研究中penA、mtrR基因主要是針對體外誘導(dǎo)頭孢曲松耐藥菌株進(jìn)行的研究，很遺憾未能進(jìn)行臨床分離頭孢曲松耐藥菌株的基因突變的研究。

綜上所述，penA基因中的A501T和G542S突變可能在頭孢曲松耐藥中起重要作用；而mtrR基因發(fā)生A39T突變的作用有待于進(jìn)一步研究。

志謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所性病科蘇曉紅教授及性病實(shí)驗(yàn)室樂文靜、李賽等