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        梅毒IgA快速檢測試劑診斷早期現(xiàn)癥梅毒的應(yīng)用性評估

        2018-06-13 06:06:50韓燕魏萬惠尹躍平DavidAnderson王紅春MaryGarciaHuyVan朱小宇陳凱陳祥生
        中華皮膚科雜志 2018年5期
        關(guān)鍵詞:梅毒試劑靈敏度

        韓燕 魏萬惠 尹躍平 David Anderson 王紅春 Mary L Garcia Huy Van 朱小宇 陳凱 陳祥生

        210042南京,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所 中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心參比實驗室(韓燕、魏萬惠、尹躍平、王紅春、朱小宇、陳凱),性病控制中心(陳祥生);Burnet Institute(David Anderson、Mary L Garcia、Huy Van)

        梅毒螺旋體在母體內(nèi)通過胎盤途徑感染胎兒,可引起早產(chǎn)、死產(chǎn)。加強孕婦的梅毒篩查,是減少梅毒垂直傳播的關(guān)鍵[1-3]。目前,梅毒的快速檢測試劑(POC,point-of-care)主要檢測梅毒的特異性抗體,不能夠有效區(qū)分現(xiàn)癥和既往梅毒感染,還需要快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR)/甲苯胺紅不加熱血清試驗(TRUST)的輔助,限制了快速檢測方法的應(yīng)用。澳大利亞Burnet研究所研發(fā)了一種可快速鑒定患者是否為早期現(xiàn)癥梅毒的POC試劑(prototype IgA rapid test),前期Burnet研究所利用墨爾本參比實驗室提供的100份血漿標(biāo)本檢測,顯示該試劑對現(xiàn)癥梅毒患者血漿(RPR滴度≥1∶8)檢測的靈敏度為91%,對既往梅毒患者血漿[梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)陰性,RPR陰性]的檢測特異性為80%。在本研究中,我們對該快速檢測試劑進行了擴大樣本量的實驗室評估。

        一、對象和方法

        1.標(biāo)本:血清標(biāo)本來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所參比實驗室。由于庫存標(biāo)本缺少患者主訴相關(guān)信息,我們主要依靠IgM酶聯(lián)免疫吸附實驗(IgM-ELISA)、IgA-ELISA檢測的結(jié)果進行未感染梅毒、既往感染梅毒和早期現(xiàn)癥梅毒的分組。本研究通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(2016-臨快審-016)。

        2.試劑:TPHA試劑、RPR試劑(英國Omega Diagnostics公司);IgA-POC及IgA-ELISA試劑均由Burnet研究所提供,其制備IgA快速檢測試紙條中所使用的IgA抗原梅毒重組抗原購自美國Meridian Life Sciences公司;IgM-ELISA試劑(德國DRG公司)。

        3.分組:標(biāo)本管理員根據(jù)標(biāo)本庫原先記錄的檢測結(jié)果進行標(biāo)本抽樣,完成抽樣后,所有標(biāo)本經(jīng)TPHA和RPR檢測,并利用IgM-ELISA發(fā)現(xiàn)TPHA和RPR檢測漏檢的早期梅毒感染者。未感染組:IgM-ELISA檢測陰性或TPHA檢測陰性且RPR檢測陰性;既往感染組:TPHA檢測陽性、RPR檢測陰性且IgM-ELISA陰性;早期現(xiàn)癥組:IgM-ELISA檢測陽性或TPHA檢測陽性、RPR檢測陽性且滴度大于1∶8。為保證檢測人員對TPHA和RPR結(jié)果的盲法,在完成分組標(biāo)本的篩選后,對標(biāo)本二次編號,號碼按照隨機數(shù)生成器產(chǎn)生,然后按序排列。實驗人員在后續(xù)過程中對所有標(biāo)本前期的檢測結(jié)果及分組信息未知。

        4.IgA-POC檢測:凍存標(biāo)本室溫孵育至室溫后,10 000×g離心5 min,加入5 μl血清標(biāo)本至檢測板的A孔,然后加入1滴磷酸鹽緩沖液(PBS),10 min后再加入4滴PBS至B孔,20 min后觀察,質(zhì)控線出現(xiàn)粉紅色條帶時檢測有效,檢測線出現(xiàn)粉紅色條帶為陽性。

        5.IgA-ELISA檢測:在96孔板中包被IgA抗原作為IgA-ELISA的檢測板。在酶標(biāo)板孔中加入100 μl標(biāo)本,37 ℃孵育1 h,洗板6次后加入100 μl抗人IgA辣根過氧化酶溶液繼續(xù)37℃孵育1 h,洗板6次后加入3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物100 μl,11 min后加入100 μl終止液,利用酶標(biāo)儀檢測吸光度(A值)。利用陰性質(zhì)控及空白質(zhì)控計算灰區(qū)值(cutoff),cutoff=(A陰性-A空白)× 0.9。每批實驗單獨計算cutoff值,檢測的吸光度大于或等于cutoff值則判為陽性,小于cutoff值判為陰性。

        6.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS 20進行統(tǒng)計分析。IgA-POC與IgM-ELISA方法靈敏度和特異性比較采用Z檢驗,IgAPOC與IgA-ELISA方法的比較采用配對資料McNemar檢測,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        二、結(jié)果

        1.基本情況:抽取庫存標(biāo)本458份,男性標(biāo)本241例,女性標(biāo)本215例,2份標(biāo)本缺少性別信息;年齡(38.2±12.3)歲。未感染梅毒148份、既往感染梅毒147份、早期現(xiàn)癥梅毒163份(表1)?,F(xiàn)癥梅毒組有9例RPR陰性、IgM-ELISA陽性,其余154例RPR滴度在1∶8至1∶256之間,其中1∶16、1∶32及1∶64這3個滴度標(biāo)本占全部標(biāo)本80%左右。

        2.IgA-POC與IgM-ELISA、IgA-ELISA檢測結(jié)果比較:3份標(biāo)本(0.65%)未出現(xiàn)質(zhì)控線,沒有納入最終IgA評估,455份血清用于檢測,結(jié)果見表2。IgM-ELISA試劑檢測結(jié)果出現(xiàn)在灰區(qū)16份,占總標(biāo)本的3.52%(16/455)。IgA-POC對早期現(xiàn)癥感染診斷的靈敏度(92.64%)高于IgM-ELISA(Z=6.88,P<0.05);對既往感染排除診斷的特異性(72.22%)低于IgMELISA(Z=6.18,P<0.05);對未感染排除診斷的特異性(97.97%)與IgM-ELISA相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.16,P=0.25)。IgA-POC對非早期現(xiàn)癥梅毒排除診斷的特異性為85.27%,約登指數(shù)為64.86%;IgM-ELISA的特異性為99.32%,約登指數(shù)為58.83%。

        IgA-ELISA與IgA-POC的檢測能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(McNemarχ2=11.70,P=0.00)(表3)。IgA-POC對早期現(xiàn)癥感染診斷的靈敏度及對既往感染排除診斷的特異性與IgAELISA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z值分別為0.21、0.26,P>0.05),但對未感染排除診斷的特異性高于IgA-ELISA(Z=4.68,P<0.05);對非早期現(xiàn)癥梅毒排除診斷的特異性為75.34%,低于IgA-POC的97.97%,約登指數(shù)為45.48%。

        表1 458份血清標(biāo)本IgM-ELISA、梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR)結(jié)果

        表2 IgA快速檢測試劑(IgA-POC)、IgM-ELISA、IgA-ELISA對不同感染狀態(tài)的梅毒血清標(biāo)本的檢測結(jié)果比較[例(%)]

        三、討論

        梅毒特異性IgM和IgA可隨著感染的時間及治療而逐漸消失[4],且分子量比較大難以通過胎盤屏障[5],因此IgM和IgA抗體的檢測可用于梅毒的早期診斷。本研究利用庫存標(biāo)本對梅毒IgA-POC進行了早期現(xiàn)癥梅毒診斷的應(yīng)用性評估,結(jié)果顯示,該試劑對早期現(xiàn)癥梅毒的發(fā)現(xiàn)能力達(dá)93%,對未感染梅毒和既往感染梅毒的排除率分別達(dá)98%和72%。目前IgA-POC尚處于研發(fā)階段,對現(xiàn)癥梅毒診斷特異性和靈敏度尚不能與美國Chembio公司梅毒雙檢的方法相媲美[6],但基本符合WHO對于新開發(fā)的POC試劑要求(臨床靈敏度和特異性均大于80%)。由于該檢測方法簡便易行,所需實驗室條件和設(shè)備要求不高,因此可以在實驗室條件簡陋的診所或現(xiàn)場調(diào)查中推廣。

        由于IgM在感染者體內(nèi)消失得較快,IgM-ELISA對早期現(xiàn)癥感染的檢測靈敏性低,應(yīng)用該方法進行現(xiàn)癥梅毒篩查時常會出現(xiàn)漏診[7],因此IgA檢測是對IgM檢測診斷早期梅毒的有效補充。而本研究通過對IgA-POC與IgA-ELISA的比較發(fā)現(xiàn),IgA-POC檢測未感染排除診斷的特異性高于IgAELISA,這可能與兩種方法的操作過程有關(guān):IgA-POC抗原包被過程是通過膠體金劃線儀將抗原劃至硝酸纖維膜上,而IgA-ELISA主要通過排槍移液器吸附至96孔板;IgA-POC的檢測為兩步法,而IgA-ELISA涉及的步驟較為繁瑣,沒有實現(xiàn)自動化,增加了人為因素的干擾。

        本研究使用的是庫存標(biāo)本,缺少臨床診斷相關(guān)信息,因此可能存在錯誤分組的情況,影響對該試劑的靈敏度和特異性的計算,需要進一步開展多中心臨床標(biāo)本評估。

        表3 IgA-ELISA與IgA快速檢測試劑(IgA-POC)檢測結(jié)果比較

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