柯吳堅(jiān) 黃濤 張君 呂萍 薛耀華 張曉輝 王柳苑 劉雅慧 鄭和平

510009廣州，南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院

不同個(gè)體感染梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）后臨床表現(xiàn)和治療反應(yīng)各異［1］，提示Tp感染過程中可能存在宿主遺傳易感性或Tp基因致病性差異［2］。然而，大量梅毒宿主遺傳易感性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphisms，SNP）數(shù)據(jù)表明，宿主SNP與Tp遺傳易感性均無顯著相關(guān)［3-5］。因此Tp基因SNP導(dǎo)致的致病性差異將成為未來的研究熱點(diǎn)［2，6］。我們從廣東地區(qū)1例梅毒患者皮損中分離Tp臨床株（命名為廣東1株，簡稱GD1株），在兔睪丸中連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過目的基因DNA片段測序分析廣東地區(qū)Tp基因編碼區(qū)非同義SNP（non-synonymous SNP，nsSNP）位點(diǎn)突變，為后續(xù)GD1株全基因組測序奠定研究基礎(chǔ)。

一、對象與方法

1.對象：患者為30歲男性，因陰莖無痛性潰瘍9 d就診。體檢：陰莖表面多個(gè)淺表無痛性潰瘍，伴雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大。實(shí)驗(yàn)室檢查：潰瘍分泌物暗視野顯微鏡檢查陰性，甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）陰性，梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）陽性。7 d后復(fù)查潰瘍暗視野顯微鏡檢查陰性，TRUST陰性，TPPA 1∶160陽性。本研究通過南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：GDDHLS-20170610），患者簽署知情同意書。

2.GD1株的分離和傳代培養(yǎng)：輕擠患者硬下疳皮損，用無針頭5 ml注射器收集皮損中的漿液性滲出液，加入到含20%非感染兔血清中，立刻接種于3月齡、體重約3 kg、經(jīng)梅毒螺旋體免疫熒光抗體試驗(yàn)（FTA）和性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）雙重驗(yàn)證排除Tp感染的成年新西蘭白兔雙側(cè)睪丸內(nèi)，每個(gè)睪丸接種1 ml。待形成睪丸炎后，兔子處予安樂死，手術(shù)取睪丸，制備成菌懸液，采用暗視野顯微鏡、TP0548 PCR、測序和基因分型多重驗(yàn)證是否傳代成功。取6 ml GD1菌懸液再次傳代于3只新西蘭白兔睪丸，剩余菌懸液采用500×g低速離心10 min，分離兔睪丸組織，吸取上清液后20 000×g離心30 min，去上清液，保留約0.2 ml濃縮GD1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。重復(fù)以上步驟，直到獲得足夠?qū)嶒?yàn)GD1菌液。實(shí)驗(yàn)動物購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（合格證號：44002100005265）。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院動物管理及使用委員會批準(zhǔn)，并參照實(shí)驗(yàn)動物管理和使用指南進(jìn)行操作。

3.TP0548基因PCR、測序和分型：應(yīng)用QIAamp DNA Mini試劑盒（德國QIAGEN公司）提取GD1菌懸液DNA，以Nichols標(biāo)準(zhǔn)株（美國華盛頓大學(xué)Sheila Lukehart教授饋贈）DNA為陽性對照，以分子水（molecular H2O，mH2O，美國Sigma公司）為陰性對照。PCR體系50 μl，模板DNA 5 μl、2.5 mmol/L dNTPs（美國Thermo公司）4 μl、10 × Go Taq PCR緩沖液（美國 Promega公司）5 μl、25 mmol/L MgCl2（美國Sigma公司）3 μl、20 μmol/L引物［生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1］0.5 μl、5 U熱啟動Taq PCR聚合酶（美國Promega公司）0.5 μl、mH2O 31.5 μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性1 min、60℃退火2 min、72℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，結(jié)果經(jīng)BLAST驗(yàn)證。TP0548基因分型和nsSNPs分別采用BioEdit多重和雙重序列比對分析。

4.泛影葡胺密度梯度離心法［7］純化GD1株：將60%泛影葡胺（上?；春Ｖ扑帍S）稀釋成37.5%、25.0%、19.0%，于硝酸纖維管中依次加入1.5 ml 60%泛影葡胺、1 ml 37.5%泛影葡胺、1 ml 25.0%泛影葡胺和1 ml 19.0%泛影葡胺，最終形成非連續(xù)梯度。將步驟2獲得的濃縮GD1株置于泛影葡胺非連續(xù)梯度離心液上層，20℃100 000×g離心45 min。離心后，在60%和37.5%泛影葡胺之間、37.5%和25.0%之間、25.0%和19.0%之間出現(xiàn)3條乳白色條帶。選取菌量多的條帶進(jìn)行nsSNP檢測。

5.TP0574 qPCR定量檢測各層GD1株菌量［8-9］：參照步驟3分別提取各條帶內(nèi)GD1株基因組DNA。用LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green試劑盒（瑞士羅氏公司）檢測各條帶的GD1菌量，以Nichols標(biāo)準(zhǔn)株DNA為陽性對照，以mH2O為陰性對照，已知濃度的TP0574質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)參。PCR總反應(yīng)體系為20 μl：5 μl待檢測DNA樣本、2 μl 20 μmol/L TP0574引物［生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1］、4 μl 5 × Master Mix（瑞士羅氏公司）、9 μl mH2O。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s、60℃退火8 s、72℃延伸13 s，共45個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物用LightCycler software（美國羅氏公司）分析。

6.PCR擴(kuò)增TP0443和TP0584 nsSNPs：取純化后的GD1株DNA作為模板，以Nichols株DNA為陽性對照，以mH2O為陰性對照，常規(guī)PCR擴(kuò)增TP0443和TP0584 nsSNPs，引物序列見表1。50 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑和擴(kuò)增條件參照步驟3。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

二、結(jié)果

1.分離培養(yǎng)出GD1株：從梅毒患者硬下疳皮損分離到的Tp接種至新西蘭白兔睪丸，約1個(gè)月形成睪丸炎，取睪丸制備菌懸液，經(jīng)暗視野顯微鏡檢查可見Tp（圖1），表明成功從硬下疳分離出具有傳染活性的臨床Tp。

2.TP0548基因PCR、測序和分型結(jié)果：GD1菌懸液DNA經(jīng)TP0548 PCR擴(kuò)增，于361 bp處可見特異性擴(kuò)增條帶（圖2）。經(jīng)BLAST比對，確認(rèn)為TP0548片段；經(jīng)BioEdit多重序列比對，為TP0548分型中的f亞型。

3.TP0574 qPCR定量檢測各層GD1株菌液濃度：以TP0574質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)參，qPCR定量檢測各層GD1菌液濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GD1株菌液在19.0%和25.0%層以及25.0%和37.5%層的濃度明顯高于37.5%和60%層。

4.GD1株TP0443和TP0584 PCR和nsSNPs測序結(jié)果：GD1菌懸液DNA經(jīng)TP0443和TP0584 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為328 bp和301 bp（圖3）。將GD1株測序結(jié)果與美國Nichols標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行nsSNPs位點(diǎn)比對，GD1株第469810位堿基由A突變?yōu)镚（圖4A），對應(yīng)第120位編碼氨基酸由蘇氨酸→丙氨酸，導(dǎo)致TP0443基因出現(xiàn)nsSNP位點(diǎn)突變；634785位堿基由G突變?yōu)锳（圖4B），對應(yīng)第314位編碼氨基酸由丙氨酸→蘇氨酸，導(dǎo)致TP0584基因出現(xiàn)nsSNP位點(diǎn)突變。

表1 梅毒螺旋體基因和非同義單核苷酸多態(tài)引物序列［7-9］

三、討論

圖1 梅毒螺旋體暗視野顯微鏡圖（×40） 圖2 梅毒螺旋體TP0548基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 1：TP0548基因；2：陽性對照；3：陰性對照；4：標(biāo)準(zhǔn)參照物

圖3 梅毒螺旋體臨床株與Nichils株TP0443和TP0584基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 1：Nichils株TP0443基因；2：臨床株TP0443基因；3：Nichils株TP0584基因；4：臨床株TP0584基因；5：TP0443陰性對照；6：TP0584陰性對照；7：標(biāo)準(zhǔn)參照物

圖4 梅毒螺旋體臨床株TP0443、TP0584基因部分序列圖4A：箭頭所示為TP0443堿基發(fā)生A→G突變；4B：箭頭所示為TP0584堿基發(fā)生G→A突變

Tong等［10］通過對廈門地區(qū)分離出的Amoy株進(jìn)行全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，Amoy株與Nichols標(biāo)準(zhǔn)株、SS14、Mexico A、DAL-1和Chicago存在良好的基因組共線性關(guān)系，Amoy株與SS14高度同源。Sun等［11］通過比較6株上海地區(qū)、1株山西地區(qū)和1株安徽地區(qū)分離的Tp全基因組發(fā)現(xiàn)，8個(gè)菌株間存在329個(gè)SNPs，其中有5個(gè)為青霉素結(jié)合蛋白nsSNPs位點(diǎn)。廣東地區(qū)梅毒菌株是否存在nsSNPs目前仍未知。本實(shí)驗(yàn)用泛影葡胺密度梯度離心法成功地從新西蘭白兔睪丸組織中分離、純化并獲得高純度的GD1株。通過比對GenBank中Nichols標(biāo)準(zhǔn)株與全球不同地區(qū)的11株臨床分離株（DAL-1、SS14、Chicago、Mexico A、Sea81-4、UW074B、UW189B、UW228B、UW254B、UW391B和Amoy）全基因序列，共篩選出2個(gè)nsSNPs位點(diǎn)。nsSNPs檢測結(jié)果證實(shí)，GD1株與美國Nichols株存在nsSNPs突變，該基因突變導(dǎo)致TP0443和TP0584的氨基酸序列出現(xiàn)改變。

國內(nèi)外Tp菌株間的nsSNPs差異除了可用于Tp分子流行病學(xué)、傳播機(jī)制和傳播效應(yīng)的研究，還為后續(xù)nsSNPs致病性差異比較、研究發(fā)病機(jī)制和Tp全基因組測序奠定基礎(chǔ)。