許卜方 王千秋 張瑞麗 張津萍

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心性病防治室（許卜方、王千秋），性病科（張津萍）；南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫第二醫(yī)院皮膚科（張瑞麗）

近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為一種直徑30～150 nm的胞外囊泡［1］，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移分化、腫瘤侵襲等［2］。外泌體攜帶的mRNA、miRNA、蛋白不僅可以作為細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)傳遞信號(hào)以調(diào)節(jié)細(xì)胞組織的功能［3-4］，還可以作為疾病的生物標(biāo)記物輔助診斷［5-6］、治療［7］、預(yù)后評(píng)估［8］。雖然梅毒的致病機(jī)制在免疫學(xué)方面已取得一些進(jìn)展，但是外泌體在梅毒中的研究未見相關(guān)報(bào)道，因此在本研究中，我們通過研究Tp誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌的外泌體特征及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的影響，從分子學(xué)角度為梅毒的致病機(jī)制提供線索。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞系和致病菌：人單核巨噬細(xì)胞（human acute monocytic leukemia cell line，THP-1）為本實(shí)驗(yàn)室保存，HUVEC來(lái)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞庫(kù)。梅毒螺旋體（Tp）Nichol株為本實(shí)驗(yàn)室保存。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在南京軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心開展［許可證號(hào)SYXK（軍）2012-0048］睪丸發(fā)育成熟的健康成年（3月余，2.5～3 kg）新西蘭雄兔來(lái)源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)（動(dòng)物合格證號(hào)201615918），在接種前后不接觸任何抗生素，質(zhì)量等級(jí)普通級(jí)，在18～20℃環(huán)境中飼養(yǎng)；所有兔在接種前進(jìn)行非螺旋體試驗(yàn)（VDRL或RPR），檢測(cè)均為陰性。

2.主要試劑及儀器：RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），CCK8試劑（日本同仁化學(xué)研究所），PKH67（美國(guó)Sigma公司），外泌體提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司，cat 76164），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Western印跡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CD63、CD9、CD81一抗及二抗（美國(guó)CST公司），OLYMPUS IX81激光共聚焦顯微鏡，JEM1230透射電鏡（日本JEOL公司），qNano Gold粒徑測(cè)試儀（新西蘭Izon Science公司）。

二、方法

1.Tp的獲?。簩p標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于新西蘭雄兔雙側(cè)睪丸，飼養(yǎng)2周后開始每2天抽取兔耳緣靜脈血1 ml進(jìn)行RPR測(cè)定，待滴度上升至1∶64左右且睪丸硬、腫時(shí)，將兔予以安樂死，無(wú)菌摘取雙側(cè)睪丸，剪碎、萃取、離心、沉淀，獲得較純的Tp用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.巨噬細(xì)胞和HUVEC培養(yǎng)：THP-1細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收集所有THP-1細(xì)胞懸液，取10 μl滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，離心棄上清液，將THP-1細(xì)胞沉淀在RPMI 1640（含10%胎牛血清）中重懸，按1×106/孔接種于100 mm×20 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入50 μg/L丙二醇甲醚醋酸酯（PMA），37℃、5%CO2孵箱中孵育約24 h后細(xì)胞貼壁，呈多角形，即分化為巨噬細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［9-10］。在DMEM（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)HUVEC，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.外泌體的提?。罕籔MA刺激分化的巨噬細(xì)胞在RPMI 1640（含10%胎牛血清）新鮮培養(yǎng)基中37℃、5%CO2繼續(xù)孵育24 h。用RPMI 1640重懸Tp，取10 μl于暗視野顯微鏡下觀察活力并計(jì)數(shù)，取1×107Tp按照10∶1（Tp與巨噬細(xì)胞）的感染數(shù)加入接種有巨噬細(xì)胞的100 mm×20 mm培養(yǎng)皿，刺激12 h［11］。更換培養(yǎng)基為含10%無(wú)外泌體的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。多次高速離心，棄沉淀，按照外泌體提取試劑盒手冊(cè)操作，加入外泌體洗脫液XE制成外泌體懸液作為實(shí)驗(yàn)組外泌體（EXOTp）。自未加Tp刺激的巨噬細(xì)胞提取的外泌體懸液為對(duì)照組外泌體（EXO）。

4.外泌體鑒定：

（1）透射電鏡觀察：吸取外泌體懸液約50 μl于26 cm×19 cm×2 cm解剖盤上。取一有支持膜的銅網(wǎng)與解剖盤上的外泌體懸液接觸，靜置3～5 min，取出銅網(wǎng)，晾干。取3%磷鎢酸溶液約50 μl滴于蠟盤上，將銅網(wǎng)放置于3%磷鎢酸染液表面染色3～5 min，取出銅網(wǎng)，白熾燈下晾干，電鏡拍照。

（2）Western印跡檢測(cè)：BCA蛋白定量法測(cè)定外泌體蛋白含量。制膠（12%分離膠，5%濃縮膠），取15 μl樣品在80 V恒壓下電泳30 min，120 V恒壓電泳1 h。轉(zhuǎn)膜2 h。5%牛血清白蛋白封閉2 h，分別加入兔抗人CD63（1∶1 000稀釋）、CD9（1∶1 000稀釋）、CD81（1∶1 000稀釋）、β微管蛋白（1∶1 000稀釋）單克隆抗體4℃過夜孵育，TBST洗膜3次，室溫孵育羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋）2 h，TBST洗膜，配制顯影液，凝膠成像系統(tǒng)下顯影曝光［12］。

5.納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（nanoparticle tracking analysis，NTA）定量測(cè)定外泌體［13］：將外泌體樣品1∶100稀釋后，取40 μl注入樣品槽中，加壓約700 Pa，讓樣品勻速通過納米孔。清洗樣品槽，在所有參數(shù)不變的情況下，再次注入已知濃度和直徑大小的標(biāo)準(zhǔn)樣品CPC100（平均直徑114 nm，濃度1× 1013顆粒/ml，稀釋倍數(shù)1∶1 000）作為參比條件，與待測(cè)樣品進(jìn)行比對(duì)。運(yùn)用軟件Izon Control Suite 3.3.2.2000對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)。

6.外泌體體外活化HUVEC：將HUVEC（1×105個(gè)）懸液接種于激光共聚焦小皿中，于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。用熒光染料PKH67對(duì)外泌體避光染色5 min，取染色后的外泌體（1×106顆粒）與HUVEC（1×105個(gè)）共培養(yǎng)5 h，棄培養(yǎng)基上清液，用PBS沖洗2遍，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

7.HUVEC吞噬外泌體后的增殖水平：將100 μl（1×104個(gè)細(xì)胞/孔）HUVEC懸液接種于96孔板，于37℃、5%CO2孵箱孵育24 h，將細(xì)胞分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、外泌體洗脫液組，根據(jù)NTA測(cè)得的濃度分別加入10 μl EXO、EXOTp（4.5 × 108顆粒）、外泌體洗脫液（XE），孵育12、24、48、72 h，孵育完畢后加入CCK8 試劑10 μl，37 ℃避光孵育2 h。每組6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組（只加培養(yǎng)基，無(wú)細(xì)胞），酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處吸光度（A值）。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組外泌體粒徑大小符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用x±s表示，采用u檢驗(yàn)；兩組外泌體濃度不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，采用配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；各組HUVEC增殖水平數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用x±s表示，數(shù)據(jù)方差不齊采用兩獨(dú)立樣本Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞和Tp形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下，由THP-1細(xì)胞分化來(lái)的巨噬細(xì)胞形態(tài)飽滿，貼壁生長(zhǎng)，圓形或橢圓形，有偽足，胞質(zhì)顆粒較多，細(xì)胞之間排列較為緊密。含血清DMEM培養(yǎng)的HUVEC呈扁平多角形，貼壁生長(zhǎng)，鋪路石狀鑲嵌排列，細(xì)胞狀態(tài)可。Tp于暗視野顯微鏡下呈纖細(xì)、白色、有折光的螺旋狀微生物。雄兔睪丸接種Tp 2周左右，出現(xiàn)睪丸腫大等炎癥癥狀。

二、外泌體鑒定

透射電鏡下實(shí)驗(yàn)組外泌體為直徑30～100 nm的微小囊泡，呈杯托樣結(jié)構(gòu)。Western印跡顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外泌體膜蛋白分子（CD63、CD9、CD81）的清晰條帶，三者相對(duì)分子質(zhì)量分別為45 000、24 000、26 000。見圖1。圖1兩組外泌體3種膜蛋白分子中CD63表達(dá)量最高，CD81次之，CD9表達(dá)量最低。

三、NTA定量測(cè)定外泌體

NTA檢測(cè)兩組外泌體囊泡直徑50～150 nm，其中對(duì)照組外泌體顆粒直徑（104 ± 29）nm，濃度［M（P25，P75）］為2.93×1010（1.465×1010，4.395×1010）顆粒/ml；實(shí)驗(yàn)組外泌體直徑（97±35）nm，濃度為3.8×1010（1.9 × 1010，5.7 × 1010）顆粒/ml。兩組外泌體顆粒直徑（u=1.90，P＞0.05）、濃度（z=-1.604，P=0.109）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、HUVEC吞噬外泌體

PKH67染色后的兩組外泌體與HUVEC共培養(yǎng)5 h后，激光共聚焦顯微鏡下觀察，兩組HUVEC形態(tài)皆正常，呈鵝卵石樣排列。胞質(zhì)內(nèi)散在分布的綠色熒光顆粒即為染色后被HUVEC吞噬的外泌體，見圖2。

五、外泌體對(duì)HUVEC增殖水平的影響

見圖3。12 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組HUVEC增殖水平均高于外泌體洗脫液組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；24 h和48 h時(shí)對(duì)照組細(xì)胞增殖水平仍高于外泌體洗脫液組，在48 h達(dá)到峰值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組與外泌體洗脫液組細(xì)胞在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)增殖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組與外泌體洗脫液組細(xì)胞增殖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

圖1 巨噬細(xì)胞分泌的外泌體鑒定 1A：透射電鏡下觀察外泌體為直徑30～100 nm的微小囊泡，呈杯托樣結(jié)構(gòu)；1B：Western印跡測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外泌體膜蛋白CD63、CD9、CD81的表達(dá)

圖2 PKH67染色后的外泌體與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）共培養(yǎng)5 h后激光共聚焦顯微鏡下的內(nèi)吞現(xiàn)象，綠色熒光顆粒為染色后的外泌體（×400）

圖3 CCK8法檢測(cè)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）被外泌體刺激12、24、48、72 h后的增殖水平 EXO：未用梅毒螺旋體刺激的巨噬細(xì)胞分泌的外泌體；EXOTp：梅毒螺旋體刺激的巨噬細(xì)胞分泌的外泌體。HUVEC吞噬外泌體后12 h時(shí)，EXO、EXOTp兩組的HUVEC增殖水平均高于外泌體洗脫液組（均P＜0.05）；24 h和48 h時(shí)EXO組細(xì)胞增殖水平仍高于對(duì)照組（P＜0.01），而EXOTp與外泌體洗脫液組細(xì)胞增殖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組與外泌體洗脫液組細(xì)胞增殖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

既往研究證實(shí)，Tp膜蛋白在梅毒致病過程中發(fā)揮重要作用。Tp借其表面的黏多糖酶吸附于細(xì)胞表面的受體，解離血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附連接，使組織壞死、炎癥發(fā)生、潰瘍形成、血管塌陷［14］。Tp對(duì)HUVEC的黏附性是上皮細(xì)胞的2倍，99%的HUVEC在Tp刺激后6 h仍有活性［15］，繼而趨化淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞［11］，從而發(fā)生一系列血管炎癥反應(yīng)致組織免疫病理?yè)p傷。

近年在炎癥性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，高血壓患者的巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可以上調(diào)冠脈內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子和纖溶酶原激活物抑制劑的表達(dá)，誘導(dǎo)冠脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)［9］。Diaz等［10］運(yùn)用蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分支桿菌后釋放的外泌體膜蛋白組成中有41種蛋白表達(dá)升高，其中63%的蛋白與細(xì)胞膜功能相關(guān)。

提取外泌體有許多方法，其中較好的是超高速離心法。本研究中，我們因受限于設(shè)備條件，退而選擇膜親和試劑盒提取外泌體，該試劑盒提取的外泌體存在純度問題，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中盡量保證實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的條件一致以減少實(shí)驗(yàn)誤差。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中設(shè)置外泌體洗脫液組作用于HUVEC，是為了評(píng)估外泌體洗脫液本身對(duì)HUVEC增殖水平的影響。

已知Tp膜蛋白直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、炎癥、通透性，因此Tp作用于巨噬細(xì)胞后分泌的外泌體中是否具有Tp膜蛋白的相關(guān)遺傳信息非常值得研究。但目前限于Tp不能體外培養(yǎng)，無(wú)法提取Tp源性外泌體，因此我們從功能學(xué)層面探討Tp刺激巨噬細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，為梅毒血管炎的分子機(jī)制研究提供一定的思路。本研究結(jié)果顯示，在體外實(shí)驗(yàn)中，Tp誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌的外泌體在大小、濃度方面與正常巨噬細(xì)胞分泌的外泌體無(wú)異，但其作用于HUVEC后使得HUVEC的增殖水平下降，提示Tp刺激巨噬細(xì)胞后分泌的外泌體可能參與梅毒血管炎的致病過程，該結(jié)論還需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

我們推測(cè)，Tp侵入宿主最初激活固有免疫應(yīng)答，巨噬細(xì)胞被活化［14］，吞噬Tp后分泌的外泌體攜帶著Tp和巨噬細(xì)胞的遺傳信息，在體內(nèi)輸送至血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞接收了外泌體攜帶的信號(hào)，調(diào)節(jié)自身的增殖水平，以削弱血管內(nèi)皮細(xì)胞的再生修復(fù)能力，繼而為Tp致血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生及進(jìn)展提供有利條件。研究證明，外泌體可以傳遞信號(hào)，改變信號(hào)通路，影響蛋白的組成，導(dǎo)致下游細(xì)胞的功能發(fā)生改變［9-10，16］。本研究顯示，HUVEC吞噬外泌體后12～48 h內(nèi)，對(duì)照組HUVEC細(xì)胞增殖水平高于外泌體洗脫液組，在48 h達(dá)到峰值；實(shí)驗(yàn)組HUVEC僅在外泌體作用12 h內(nèi)增殖水平高于外泌體洗脫液組，隨著時(shí)間的推移，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖水平趨于正常。推測(cè)THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞可能分泌攜有促進(jìn)細(xì)胞增殖信號(hào)的外泌體作用于HUVEC使其增殖水平升高，而EXOTp可能攜有抑制/阻斷細(xì)胞增殖信號(hào)表達(dá)的相關(guān)遺傳信息，使其作用于HUVEC后僅在12 h內(nèi)提高增殖水平，后恢復(fù)至正常水平。在72 h時(shí)3組間細(xì)胞增殖水平無(wú)明顯差異，說明外泌體在體外與HUVEC共培養(yǎng)72 h后不再影響HUVEC的增殖水平。這其中EXOTp影響HUVEC增殖的原因究竟是Tp本身的遺傳信息作用，還是巨噬細(xì)胞受Tp刺激后發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)信號(hào)作用，以及EXOTp對(duì)HUVEC增殖的影響與血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生是否相關(guān)，目前都尚不能明確，我們將在以后的研究中對(duì)此進(jìn)行深入探討。