洪 虹，岳 雪，李大成，王炳全，董惠鈞

(1.聊城市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 聊城 252000；2.聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252000；3.聊城大學(xué) 生物制藥研究院，山東 聊城 252000)

環(huán)孢菌素是十一環(huán)肽的免疫抑制劑，是由絲狀真菌多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)合成的環(huán)肽次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要用于器官移植免疫排斥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紫癜以及銀屑病等自身免疫疾病的治療[1]。隨著臨床研究的深入，環(huán)孢菌素A在膜性腎病、腎病綜合征以及IgA腎病方面顯示出良好的治療效果[2-4]。

T.inflatum在分泌環(huán)孢菌素A過程中，會(huì)分泌一種色素，而且色素與環(huán)孢菌素A的合成相互影響，但其中的機(jī)制并不明了。通常，真菌分泌的色素主要是聚酮類和蒽醌類，都由聚酮合酶(PKS)催化合成[5-7]。研究最深入的真菌色素是紅曲菌產(chǎn)生的紅曲色素，其PKS合成基因簇已被克隆和鑒定[8-9]。謝娜娜等[10]研究發(fā)現(xiàn)：紅曲菌的色素和毒素桔霉素分別由獨(dú)立的PKS合成基因簇控制合成，而且兩者的合成途徑相互影響，將編碼紅曲色素的pksPT基因敲除后，紅曲菌不再產(chǎn)生任何色素，而且桔霉素產(chǎn)量提高了2.8倍，推測(cè)桔霉素和色素的合成互相競(jìng)爭(zhēng)小分子前體物。彭瑤等[11]發(fā)現(xiàn)不同的色素合成基因簇缺失對(duì)井岡霉素的合成有不同的影響，多巴類黑色素與井岡霉素的生物合成過程競(jìng)爭(zhēng)共同前體酪氨酸，將多巴類黑色素基因簇敲除可以提高井岡霉素的產(chǎn)量。

本文旨在通過全基因組挖掘技術(shù)分析T.inflatumPKS基因合成基因簇，并進(jìn)一步解析與色素合成相關(guān)的基因簇或基因，為研究T.inflatum中環(huán)孢菌素A和色素合成之間的相互作用關(guān)系提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

460型紅外光譜儀，美國尼高力公司；UV3600 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；1100LC/MSD 型質(zhì)譜儀、PrepHT制備型色譜柱 (21.5 mm×150 mm)，美國安捷倫公司；Mercury Plus 400 型核磁共振波譜儀，美國瓦里安公司；PE2400 II 型元素分析儀，美國鉑金埃爾默公司；P270 型制備型高效液相色譜儀，大連依利特公司。

甲醇、乙腈、乙醇及氯仿等試劑均為分析純，汕頭西隴化工公司；氘代水，上海金穗生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1T.inflatum色素的分離純化

按照前期工作提供的方法[12]從T.inflatum培養(yǎng)液中分離純化色素，主要步驟分為固液分離、柱層析和高壓制備液相。首先，收集T.inflatum培養(yǎng)液2 000 mL，減壓過濾去除菌絲體，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇淋洗濾餅2次，收集濾液上樣弱極性大孔吸附樹脂 X-5 層析柱，收集流出液。其次，減壓濃縮除去乙醇，用低沸點(diǎn)石油醚(70～90 ℃)萃取2次，合并萃取相并經(jīng)減壓濃縮至干。用氯仿-甲醇-水混合流動(dòng)相(體積比為50∶ 40∶ 10)溶解上述濃縮物，過濾除去不溶性雜質(zhì)，上48～75 μm層析硅膠柱，觀測(cè)紅色素層析帶的位移并收集紅色素部分。最后，將收集的紅色素溶液減壓濃縮至干，再通過制備型高效液相色譜分離純度大于99%的紅色素。制備高效液相色譜流動(dòng)相為氯仿-甲醇-水混合溶液(體積比為10∶ 70∶ 20)，流速 5 mL/min，檢測(cè)波長為 237 nm，收集高純度流出液，60 ℃減壓濃縮，40 ℃真空干燥獲得色素純品，色素的純度由 HPLC 檢測(cè)分析，由歸一化法計(jì)算純度，然后對(duì)制得的紅色素粉末進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.2T.inflatum色素的分析鑒定

參照文獻(xiàn)[12]的方法對(duì)高度純化的T.inflatum分泌的色素進(jìn)行紫外、紅外光譜、質(zhì)譜、元素分析和核磁共振分析。

1.2.3 PKS基因簇預(yù)測(cè)分析

采用在線分析軟件antiSMASH(http://antismash.secondarymetabolites.org)對(duì)T.inflatum的全基因組(ID：AOHE00000000)進(jìn)行分析，解析其次級(jí)代謝基因簇。

1.2.4 色素合成基因簇相關(guān)基因分析

首先使用NCBI蛋白結(jié)構(gòu)在線數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)預(yù)測(cè)的各開放閱讀框(ORF)進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析；再用在線保守功能域搜索工具M(jìn)otif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)驗(yàn)證結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果。最后采用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，預(yù)測(cè)基因功能。

采用ExPASy(http://www.expasy.org/)在線數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)分析蛋白性質(zhì)。使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件計(jì)算蛋白質(zhì)的大小、等電點(diǎn)(PI)和氨基酸組成等理化性質(zhì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 T. inflatum色素的分離純化結(jié)果

T.inflatum色素是在環(huán)孢菌素A生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的一種胞外次級(jí)代謝產(chǎn)物，使發(fā)酵液呈淺紅至紅棕色。在前期的工作中，筆者所在課題組建立了固液分離、柱層析和高壓制備液相色譜分離紅色素的方法和工藝[12]。筆者在前期工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)柱層析工藝和高壓制備液相的流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化和調(diào)整。硅膠柱層析的流動(dòng)相由乙酸乙酯-石油醚(體積比為46∶ 54)變?yōu)槁确?甲醇-水混合流動(dòng)相(體積比為50∶ 40∶ 10)，高壓制備液相流動(dòng)相由甲醇-乙腈-水(體積比為42∶ 33∶ 35)變?yōu)槁确?甲醇-水(體積比為10∶ 70∶ 20)，使用改進(jìn)的流動(dòng)相分離色素，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，色素的純度達(dá)到99.1%，能夠達(dá)到結(jié)構(gòu)鑒定的要求。

2.2 T. inflatum色素的結(jié)構(gòu)鑒定

在前期的工作中，我們通過紫外和紅外光譜分析初步確定，T.inflatum色素可能為蒽醌類物質(zhì)[12]。本文中，筆者進(jìn)一步通過電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)來分析色素，結(jié)果見圖2。由圖2可知：色素在m/z為271 處有強(qiáng)吸收的分子離子峰，色素的分子量應(yīng)為270。

元素分析測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：色素中的C元素為 66.4%，H元素為 3.5%，O元素為 29.6%，沒有N、S 和 P元素，初步推斷色素分子式為 C15H10O5，不飽和度為11，應(yīng)為含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。

進(jìn)一步采用核磁共振碳譜和氫譜以及二維譜圖對(duì)色素進(jìn)行解析，結(jié)果見圖3。由圖3可知：除化學(xué)位移δ40附近的溶劑峰外，具有不同化學(xué)位移的碳原子共有15個(gè)，分別是192.4、182.1、162.5、162.2、154.6、138.2、134.0、133.8、125.2、121.5、120.2、117.9、116.6、115.1和62.9，并且絕大部分類型的碳原子處于化學(xué)位移δ100～200的較低場(chǎng)和最低場(chǎng)，因此可判定色素的碳原子數(shù)目為15，而且主要為苯環(huán)上多取代的無氫碳原子。

圖2 色素的ESI-MS分析Fig.2 Analysis of purified pigment by ESI-MS

圖3 色素純品的13C NMR和1H NMR圖譜Fig.3 13C NMR and 1H NMR graphs of purified pigment

通過無畸變極化轉(zhuǎn)移技術(shù)(distortionless enhancement by polarization transfer，DEPT)對(duì)核磁共振譜圖進(jìn)行二次數(shù)據(jù)處理，辨別碳譜中的伯碳、仲碳、叔碳和季碳。DEPT90譜圖只顯示次甲基向上的峰，DEPT135譜圖則顯示甲基、次甲基的峰向上，亞甲基峰向下(信號(hào)為負(fù))。利用無畸變極化轉(zhuǎn)移技術(shù)對(duì)來源于T.inflatum的色素進(jìn)行DEPT90和DEPT135分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知：色素中含有5個(gè)—CH官能團(tuán)和1個(gè)—CH2官能團(tuán)。結(jié)合氫譜的結(jié)果：在位移低場(chǎng)11.94處應(yīng)為酚羥基氫，數(shù)目為2，其余氫譜位移分別為7.80(t，J=8.0 Hz，1H)，7.68～7.71 (m，2H)，7.39 (d，J=8.0 Hz，1H)，7.29 (s，1H)，5.62 (brs，1H)，4.63 (d，J=4.0 Hz，2H)。

圖4 DEPT90和DEPT135分析Fig.4 Analysis of purified pigment by DEPT90 and DEPT135

綜上分析，T.inflatum色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)是含有3個(gè)酚羥基和2個(gè)酮基的蒽醌類物質(zhì)(圖5)，經(jīng)檢索對(duì)比，T.inflatum色素與蘆薈大黃素的結(jié)構(gòu)類似。蘆薈大黃素是一種具有抗菌、抗腫瘤和免疫抑制活性的物質(zhì)，因此，我們推測(cè)T.inflatum色素也具有生理活性，下一步我們將對(duì)其生物活性開展相關(guān)研究。

圖5 T. inflatum色素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.5 Chemical structure of T. inflatum pigment

2.3 T. inflatum PKS次級(jí)代謝基因簇分析

T.inflatum的次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富，在已測(cè)序的基因組中發(fā)現(xiàn)含有豐富的非核糖體肽合成酶基因簇(NRPS)和聚酮合酶基因簇(PKS)[13]，其中環(huán)孢菌素A就是由非核糖體肽合成酶基因簇合成。在培養(yǎng)T.inflatum的過程中發(fā)現(xiàn)，菌株會(huì)在分泌環(huán)孢菌素A的同時(shí)耦合生成一種紅色素，而且環(huán)孢菌素A產(chǎn)量與紅色素產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[12]，表明環(huán)孢菌素A與紅色素合成途徑之間有相互作用，但紅色素的生物合成途徑以及與環(huán)孢菌素A合成之間的相互作用機(jī)制不清楚。

采用antiSMASH在線軟件對(duì)T.inflatum的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明：T.inflatum共有43個(gè)次級(jí)代謝合成基因簇，其中，有13個(gè)與非核糖體多肽合成途徑(NRPS)相關(guān)，15個(gè)與Ⅰ型聚酮合酶(T1PKS)途徑相關(guān)，7個(gè)與NRPS-T1PKS途徑相關(guān)，3個(gè)與萜類(terpene)途徑相關(guān)以及5個(gè)未知功能的基因簇。在15個(gè)T1PKS基因簇中，可能的次級(jí)代謝產(chǎn)物有白灰制菌素、鐮刀菌紅素、密擠青霉酸和吡里哌若平(表1)。

表1 T. inflatum中Ⅰ型PKS合成基因簇的功能預(yù)測(cè)

2.4 色素合成基因簇相關(guān)基因分析

通過antiSMASH預(yù)測(cè)的T.inflatum色素合成基因簇，結(jié)果見圖6。由圖6可知：該色素的合成基因簇中共有19個(gè)開放閱讀框(ORFs)，長度為47.2 kb，其中核心合成基因?yàn)榫幋a甲基轉(zhuǎn)移酶的ORF59和編碼聚酮合酶的ORF60。除了核心基因外，該基因簇還含有氧甲基轉(zhuǎn)移酶、丁酰輔酶A還原酶、乙醇脫氫酶和短鏈脫氫酶等酶促基因，還有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，具體分析結(jié)果見表2。

圖6 T. inflatum可能的色素合成基因簇Fig.6 Putative biosynthetic gene cluster of T. inflatum pigment

表2 T. inflatum色素合成基因簇中可能的基因功能

2.5 色素PKS合成基因KS保守結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化

PKS合成基因簇中通常由AT和KS結(jié)構(gòu)域組成，其中KS結(jié)構(gòu)域的保守性最強(qiáng)。以T.inflatum色素合成基因簇KS結(jié)構(gòu)域?yàn)閷?duì)象，采用Mega6.0軟件構(gòu)建了KS結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖7。由圖7可知：預(yù)測(cè)的色素合成基因簇中KS結(jié)構(gòu)域與T.ophioglossoides的孢子黃色素合成基因蔟處在相同的進(jìn)化分支，相似度最高；另外，該KS結(jié)構(gòu)域與鐮刀菌紅素以及其他真菌的孢子色素合成基因簇同源性亦很高。

再將預(yù)測(cè)的色素合成基因簇與3種同源性較高的色素合成PKS基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見圖8和表3。由圖8可知，T.inflatum色素與鐮刀菌紅色素以及孢子黃色素的PKS合酶的保守結(jié)構(gòu)域類似，都有PKSD結(jié)構(gòu)域，而且T.inflatum色素和鐮刀菌紅素的分子結(jié)構(gòu)類似,但PKS合酶的大小差異較大,T.inflatum色素的PKS合酶由1 997個(gè)氨基酸組成,等電點(diǎn)為5.97,而鐮刀菌紅素的PKS合酶的大小為3 733個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為5.32(表3)。通過上述生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的T.inflatum色素可能的合成基因簇仍需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖7 真菌色素KS結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of conserved KS domain from fungus

圖8 高同源性的色素PKS合成酶保守功能域Fig.8 Conserved domains of hiher homologous PKS enzymes

色素種類PKS合成酶氨基酸長度(aa)等電點(diǎn)(PI)不穩(wěn)定系數(shù)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)孢子黃色素2 2796.1238.6(stable)鐮刀菌紅素3 7335.3241.89(unstable)多孔木霉色素1 9975.9740.21(unstable)

3 結(jié)論

通過分離純化方法獲得了T.inflatum色素純品，并鑒定了其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)，該色素是一種蒽醌類物質(zhì)，分子式為C15H10O5。通過生物信息學(xué)方法進(jìn)一步分析，初步確定了T.inflatum合成的基因簇，該基因簇長度大約為47.2 kb，編碼43個(gè)ORFs，核心基因?yàn)镻KS合成酶基因，而且PKS合成酶與鐮刀菌紅素的同源性非常高，二者合成的目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似。在下一步中研究中，我們將結(jié)合本研究所解析的T.inflatum色素合成途徑，以闡明該色素與環(huán)孢菌素A合成之間的相互關(guān)系。

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