羅 虎,劉慶國,陳 勇,孫振江,李永恒,許旺發(fā)

(1.廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司，廣西 北海 536100；2.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京 210032)

由于石油資源和其他化石能源的過度開采，能源危機已成為世界性的問題，尋找清潔可再生能源是當今最為迫切的任務[1]。生物乙醇是通過生物質(zhì)(如糖蜜、玉米或秸稈纖維素等)進行生物厭氧發(fā)酵制得，具有無污染、可再生性等優(yōu)點[2]；而且它能與汽油以任意比例混合，可有效替代部分石油資源，從而降低對石油需求的壓力。在我國燃料乙醇工業(yè)生產(chǎn)中，二代纖維乙醇受高成本的預處理技術(shù)影響，限制了大規(guī)模生產(chǎn)，木薯和玉米依然是乙醇發(fā)酵的兩大主要發(fā)酵原料[3]。

目前,國內(nèi)主流的乙醇發(fā)酵工藝幾乎都是大接種量的游離發(fā)酵工藝，該工藝存在發(fā)酵周期長、淀粉利用率不高等問題。相對于傳統(tǒng)游離發(fā)酵過程中的不足，固定化酵母因其具備明顯的優(yōu)勢,在燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)上得到了越來越廣泛的關(guān)注和應用。固定化酵母發(fā)酵具有底物耐受性強、發(fā)酵周期短以及對原料轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點[4]。傳統(tǒng)的固定化方法主要采用凝膠包埋技術(shù)，如卡拉膠、海藻酸鈣、自絮凝技術(shù)以及近年來流行的新型吸附介質(zhì)秸稈渣等[5]。艾特玲[6]采用脫木素鋸末和海藻酸鈉固定化酵母細胞，同時考察固定化酵母細胞產(chǎn)乙醇的效果；發(fā)酵的結(jié)果表明:最優(yōu)預處理條件下的稻草進行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，接種固定化酵母細胞發(fā)酵96 h后，乙醇得率為0.370 g/g。郭藝山等[7]以多孔鋼渣、硅藻土和珍珠巖等材料為細胞宿主載體，采用空化制泡工藝制備成多孔質(zhì)固化載體，并應用于糖蜜酒精發(fā)酵中，結(jié)果表明，該載體具有良好的力學強度和優(yōu)良的發(fā)酵特性，發(fā)酵酒度達11%(體積分數(shù)) 。目前研究的這些載體雖具有成型方便及固定化密度高等優(yōu)點，但存在固定化成本高、溶液傳質(zhì)效果差及對物料要求較高(如，不溶性固含物濃度要足夠低)等缺陷，從而限制了在工業(yè)上的應用。

針對目前固定化發(fā)酵過程中的不足，筆者提出了基于微生物集群效應的生物膜催化體系，利用化學修飾的方法以實現(xiàn)介質(zhì)表面與微生物細胞表面功能基團的對接，在此介質(zhì)誘導下，酵母能快速富集并產(chǎn)生大量的生物膜，從而使得酵母乙醇耐受性明顯提高。此吸附介質(zhì)具有成本低、吸附能力高效及力學強度高等優(yōu)點。本文中，筆者首先進行1 t級試驗的工藝條件優(yōu)化(影響固定化發(fā)酵的主要因素)；其次，對比游離和固定化工藝的發(fā)酵效果，研究不同淀粉質(zhì)原料和不同初始糖含量對發(fā)酵的影響，并分析固定化發(fā)酵工藝的可行性,以期達到開發(fā)新的燃料乙醇生產(chǎn)工藝的目的。

1 材料和方法

1.1 菌株

釀酒酵母1308，由河南南陽天冠集團提供。

1.2 培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、酵母膏10、蛋白胨20、無水MgSO40.5、(NH4)2SO44、KH2PO41.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木薯與料按一定比例混合拌勻，配好后，調(diào)pH至5.5～6.0；然后按14 U/g的量加入液化酶(奧谷液化酶單位:30 000 U/mL)；86 ℃攪拌水解2 h，降溫至34 ℃保溫。

種子培養(yǎng)及擴大培養(yǎng)：菌株經(jīng)麥芽汁(140 g/L)斜面30 ℃活化2 d后，進行搖瓶種子培養(yǎng)(32 ℃、150 r/min)，再經(jīng)過100 L種子罐和1 t種子罐擴培，32 ℃通入無菌空氣(流量4 m3/h)培養(yǎng)10～16 h。

細胞固定：纖維材料先后置于質(zhì)量濃度為10 g/L的丁二酰亞胺水溶液和5 g/L的丙二醛水溶液中，分別常溫浸泡2 h，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后烘干，并填裝于1 t發(fā)酵罐中；然后將發(fā)酵罐121 ℃滅菌20 min；再將培養(yǎng)好的種子壓入發(fā)酵罐，打開循環(huán)泵(流量1.5 m3/h)，循環(huán)若干時間至吸附量達到一定值后停止固定，排出廢液。

發(fā)酵產(chǎn)酒精：將液化好的木薯液化醪壓入發(fā)酵罐，加入0.2 g/L的尿素和MgSO4及200 U/g的糖化酶(神舟糖化酶，單位為10萬U/mL)，循環(huán)量為1 m3/h,特定條件下發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后，排出的發(fā)酵醪稱質(zhì)量。

30 t罐發(fā)酵工藝流程與1 t發(fā)酵罐的發(fā)酵方法類似。

1.3 分析方法

1.3.1 還原糖、總糖及淀粉率的測定

還原糖測定采用斐林試劑滴定法：準確稱取被測醪液10.0 g，定容至250 mL，混合搖勻，再用潔凈的移液管準確吸取5.00 mL試樣，放入裝有混合均勻的斐林甲、乙液各5 mL的三角瓶中，再加入蒸餾水25 mL，混勻后用0.25%葡萄糖進行滴定，計算見式(1)。

(1)

式中:A為空白滴定消耗0.25%葡萄糖標準溶液體積的數(shù)值(mL)；B為滴定試樣消耗0.25%葡萄糖標準溶液體積的數(shù)值(mL)。

總糖測定方法：先量取充分混勻的發(fā)酵液50 mL,注入250 mL三角瓶中，加水40 mL和20%的鹽酸10 mL，置沸水浴中轉(zhuǎn)化1 h，用200 g/L NaOH溶液中和至微酸性，過濾到250 mL容量瓶內(nèi)，定容至刻度，搖勻；然后參照還原糖的方法進行測定。

淀粉測定方法：準確稱取原料3 g，加水90 mL和20%的鹽酸10 mL加熱酸解，然后參照總糖的測定方法。

1.3.2 酒精度、酸度、細胞數(shù)、出芽率及死亡率的測定

酒精度測定：稱取發(fā)酵醪100 g蒸酒至100 mL,然后用酒精度計測量酒度。

酸度測定：于150 mL三角瓶中注入20 mL蒸餾水，加2滴酚酞，用0.1 mol/L NaOH滴定至微紅色，再吸取1 mL濾液，繼續(xù)用NaOH滴定至再次出現(xiàn)粉紅色，在30 s內(nèi)不褪色為終點，第2次NaOH滴定的毫升數(shù)乘以10為酸度。

細胞數(shù)、出芽率及死亡率測定：取2.5 mL發(fā)酵醪，稀釋至100 mL,滴加1 mL次甲基藍,搖勻，靜置1 min后用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.3.3 掃描電鏡觀察細胞形態(tài)

酵母固定化載體先進行真空冷凍干燥，然后利用掃描電鏡(model JSM-6010型，日本JEOL 公司)觀察細胞形態(tài)。

1.3.4 淀粉利用率和糧耗

淀粉利用率及生產(chǎn)1 t乙醇所需的糧耗計算分別見式(2)～(3)。

淀粉利用率 =(總出料量×酒精度×0.01×0.789)/(木薯質(zhì)量×淀粉含量×0.567 9)×100%

(2)

標準糧耗 =(木薯質(zhì)量×淀粉含量)/(總出料量×酒精度×0.789×0.01×0.7)

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 小試發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

溫度是燃料乙醇發(fā)酵過程中重要的工藝參數(shù)，對酵母細胞活性和糖化酶活力均有較強的影響[8]。如果溫度過低，酵母酶活性低，發(fā)酵能力較弱，初始糖化酶酶解速率較低，最終表現(xiàn)為總糖消耗不徹底，殘留總糖濃度較高，從而影響淀粉利用率。為了優(yōu)化固定化發(fā)酵工藝條件,在1 t發(fā)酵罐中，首先考察溫度對固定化酵母發(fā)酵的影響，結(jié)果見表1。

表1 溫度對固定化發(fā)酵的影響

由表1可知：發(fā)酵平均初始總糖質(zhì)量濃度235.0 g/L，每個條件重復了3～5批(下同，染菌時除外，另外，因數(shù)據(jù)較多，只給出了各個條件下的平均值)。當溫度較低時(30 ℃)，反應速度較慢，殘留總糖較高。初始溫度調(diào)至34 ℃，殘留總糖明顯升高，酒精度達到13.7%,淀粉利用率相比低溫提高2.6%，糧耗也降低5.4%；當溫度繼續(xù)長高后，殘留總糖有明顯上升的趨勢，細胞密度也有明顯提高，酸度發(fā)生明顯變化，生酸幅度較大，酒精度下降幅度也較大。這與沈飛等[9]在固定化酵母發(fā)酵甜高粱莖稈汁液制取酒精的研究結(jié)果較為一致。在42 ℃時，淀粉利用率降低至81.0%，糧耗相比34 ℃時的值更是提高了9.1%。結(jié)果說明，溫度過低和過高均不利于固定化酵母發(fā)酵。

這是因為發(fā)酵溫度過高，酵母活性較強，發(fā)酵過程中生長速度過快，加速酵母老化，尤其溫度上升至42 ℃，發(fā)酵過程中酵母死亡率較高(15%～25%)，發(fā)酵后期可達30%左右。同時，溫度升高加大了染菌風險，表現(xiàn)為雜菌濃度高，生酸幅度大。另外，高溫度加快了初期糖化酶酶解速度，導致初始還原糖濃度高，抑制酵母發(fā)酵能力。

2.1.2 初始pH對發(fā)酵的影響

發(fā)酵液的初始pH對酵母發(fā)酵也具有重要的影響。當pH較低時，可以有效避免發(fā)酵液染菌，但將影響糖化酶酶解效果，使得總糖利用不徹底；另外，低pH會使胞內(nèi)pH降低,導致細胞的生長和代謝受到嚴重抑制，降低了總糖的消耗速度[10]；而當pH較高時，雖然有利于菌體生長，同時也促進雜菌大量繁殖，導致酸度上升，抑制酵母發(fā)酵。因此，考察不同初始pH對固定化發(fā)酵工藝的影響，結(jié)果見表2。

表2 初始pH對固定化發(fā)酵的影響

由表2可知：在pH 3.8條件下，發(fā)酵終點的酸度僅為4.5，生酸幅度為1.5，有效抑制了雜菌生長。淀粉利用率明顯提高。將pH調(diào)至5.0，發(fā)酵終點的酸度和酵母細胞密度明顯上升，但殘留總糖略有提高，淀粉利用率降低明顯，糧耗變化也較大。當pH提高至5.5時，酸度達到6.5，達到染菌的標準，殘留總糖量較高，酵母細胞密度較低，且酒精度僅有11.9%，高殘?zhí)呛透咚岫戎祵е略摋l件下的淀粉利用率降至79.3%，糧耗相比最優(yōu)pH條件下的水平，提高了11.1%。因此，該體系的最佳pH為4.4，此環(huán)境下最有利于酵母發(fā)酵，其產(chǎn)量和原料轉(zhuǎn)化率最高，這與文獻研究結(jié)果一致[11-13]。

2.1.3 循環(huán)量對發(fā)酵的影響

考察循環(huán)量對發(fā)酵的影響，結(jié)果見表3。由表3可知，將循環(huán)量從1.0 m3/h調(diào)至2.0 m3/h，殘留總糖明顯上升，酒精度高達13.9%(體積分數(shù))，淀粉利用率達到最高值86.7%，糧耗降至2.89 t。當循環(huán)量調(diào)至3.0 m3/h，殘留總糖水平略有下降，細胞密度較高，酒精度、淀粉利用率及糧耗變化不明顯。由此可見，在一定范圍內(nèi)，循環(huán)量對固定化酵母發(fā)酵影響較大，主要在于傳質(zhì)效果明顯提高，利于糖化酶對作用底物的水解和改善，并利于酵母細胞的生長[14]。

表3 循環(huán)量對固定化發(fā)酵的影響

2.2 中試規(guī)模發(fā)酵實驗結(jié)果

2.2.1 游離酵母發(fā)酵與固定化發(fā)酵對比

為了評估固定化酵母應用價值，在最佳的工藝條件下，進行了30 t罐放大試驗，并在同一發(fā)酵罐中，利用同一物料和同一發(fā)酵溫度，模擬了傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)方式(中糧現(xiàn)有生產(chǎn)工藝：接種量30%，24 h補料至滿罐發(fā)酵)，將數(shù)據(jù)進行了對比分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知：固定化酵母發(fā)酵速度明顯快于游離酵母發(fā)酵。游離酵母水平明顯低于后者，且隨著反應批次的變化，固定化體系中游離酵母細胞密度有降低的趨勢，并于第3批趨于穩(wěn)定?？偺堑南乃俣入S著批次的增加，也有明顯加快的現(xiàn)象；另外，還原糖在初期時濃度較高，說明載體對糖化酶有少量吸附的作用，可以加強連續(xù)批次發(fā)酵時的酶解作用。

進一步分析不同發(fā)酵方式對生產(chǎn)燃料乙醇的影響，結(jié)果見表4。

由表4可明顯看出：在固定化酵母發(fā)酵中，總糖利用較為徹底，酒精度明顯較高，而游離的酵母密度大幅降低，最終的淀粉利用率比游離的高3.5%，糧耗降低了4.2%。相關(guān)研究表明：固定化載體可促進菌體形成明顯的生物膜，降低細胞毒害作用[15-16]，因此，筆者利用掃描電子顯微鏡來檢查酵母在載體上固定化的情況，結(jié)果見圖2。由圖2可知：固定化酵母在載體上產(chǎn)生群聚現(xiàn)象，這樣會發(fā)酵速度加快，這與文獻[15-16]的研究結(jié)果一致。另外，殘留總糖和游離酵母細胞密度水平明顯降低，表明固定化酵母對總糖的利用效果較高，從而表現(xiàn)出高淀粉利用率和低糧耗。

圖1 游離酵母發(fā)酵工藝與固定化發(fā)酵效果對比Fig.1 Comparison of traditional free fermentation process and immobilized fermentation

圖2 固定化酵母發(fā)酵時載體表面吸附的酵母菌群Fig.2 SEM image of yeast colony adsorbed on carrier surface during immobilized yeast fermentation

表4 發(fā)酵方式效果對比

注：①這是實際試生產(chǎn)中的第3批和第4批的平均值。

2.2.2 不同淀粉質(zhì)原料對發(fā)酵的影響

由于工業(yè)生產(chǎn)原料多樣性，有必要考察不同初始糖和玉米粉原料對固定化酵母發(fā)酵的影響,結(jié)果見表5。

表5 不同淀粉質(zhì)原料對固定化發(fā)酵效果對比

由表5可知：將木薯原料比例提高，發(fā)酵后殘留總糖水平略有提高，淀粉利用率下降1.4%，糧耗略有提高。另外，改用玉米原料后，殘留總糖濃度較高，主要由于酶解不徹底。細胞密度升高，可能源自玉米淀粉中較為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進了細胞的生長。酒精度與木薯發(fā)酵條件下的水平相當，淀粉利用率略低于木薯發(fā)酵乙醇的值，糧耗提高不明顯。由此可知，當總糖質(zhì)量濃度在260.0 g/L以下，固定化酵母發(fā)酵不受明顯影響，在高濃度初始糖發(fā)酵條件下，酒精度達15.3%，說明固定化酵母可實現(xiàn)高濃度乙醇發(fā)酵，這可降低后期蒸酒能耗。另外，原料來源不同，對固定化酵母發(fā)酵影響不大，說明基于微生物集群效應的固定化酵母發(fā)酵體系具有較強的應用性。

3 結(jié)論

1) 1 t級試驗結(jié)果表明：在最優(yōu)的條件(溫度34 ℃、初始pH 4.4、循環(huán)量為2.0 m3/h)下發(fā)酵，淀粉利用率可達86.7%，1 t乙醇的糧耗為2.89 t。

2) 在30 t中試規(guī)模水平上，對比了固定化發(fā)酵與游離細胞發(fā)酵的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明：固定化酵母發(fā)酵總糖消耗更徹底，游離細胞水平更低，最終淀粉轉(zhuǎn)化率比游離酵母發(fā)酵提高了3.5%，糧耗降低了4.2%。

3) 在高濃度糖條件下，固定化酵母發(fā)酵酒精度可達15.3%(體積分數(shù)),實現(xiàn)了高濃度酒精發(fā)酵；另外，利用玉米原料，同樣可以達到長期穩(wěn)定發(fā)酵的效果，滿足工業(yè)原料多元化的生產(chǎn)。

本研究結(jié)果表明，利用微生物集群效應的發(fā)酵體系具有較強的工業(yè)應用價值。

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