馬梓承，古金元，彭 濤，王玉超，孟凡亮，劉照虎，王宏宇，胡東方，王方坤，劉思當(dāng)（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安 271000）

1 沙門氏菌分類與臨床病變

豬沙門氏菌?。⊿wine salmonellosis）是由沙門氏菌屬包括豬霍亂沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌變型、豬傷寒沙門氏菌、豬傷寒沙門氏菌變型、鼠傷寒沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等細(xì)菌引起的一種傳染病，多發(fā)生于2～4月齡仔豬，故又稱仔豬副傷寒。該菌兩端鈍圓，無芽孢無莢膜，有鞭毛，能運動，革蘭氏染色陰性。沙門氏菌為需氧或兼性厭氧菌，適宜生長溫度為 34 ℃，適宜 pH 為 6.7～7.7，在普通的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可，對營養(yǎng)需要不高，菌落呈圓形，直徑為2～3 mm，光滑整齊，無色半透明，濕潤，對外界因素如光照等有一定的抵抗力，可以生存數(shù)周或數(shù)月，常用化學(xué)消毒劑可以將其殺死，對消毒藥抵抗力不強(qiáng)。多數(shù)沙門氏菌具有毒素，尤其是腸沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，具有很強(qiáng)的毒性，75℃加熱1 h毒力依然存在，人食用可引發(fā)中毒[1]。

1.1 不同類型沙門氏菌感染豬后的臨床表現(xiàn)

豬副傷寒沙門氏菌。急性型：又稱敗血型，多發(fā)生于斷乳前后的仔豬，常突然死亡。病程稍長者，表現(xiàn)體溫升高（41～42 ℃），腹痛，下痢，呼吸困難，耳根、胸前和腹下皮膚有紫斑，多以死亡告終。病程1～4 d。亞急性和慢性型：為常見病型；表現(xiàn)為體溫升高，眼結(jié)膜發(fā)炎，有膿性分泌物；初便秘后腹瀉，排灰白色或黃綠色惡臭糞便。病豬消瘦，皮膚有痂狀濕疹。病程持續(xù)可達(dá)數(shù)周，終至死亡或成為僵豬。

豬霍亂沙門氏菌。豬霍亂沙門氏菌是副傷寒沙門菌的一種，是引起仔豬副傷寒的主要病原菌，可見病畜體溫升高，精神沉郁，食欲減退，發(fā)抖，常趴下不起身。

腸炎沙門氏菌。腸炎沙門氏菌是引起急性胃腸炎的主要病原菌，感染后的典型癥狀包括發(fā)熱、腹瀉和嘔吐等。

鼠傷寒沙門氏菌。感染后臨床表現(xiàn)可分為4型，即胃腸炎型、敗血癥型、病灶感染型和無癥狀帶菌型。蒼蠅、跳蚤是傳播媒介。感染主要通過受污染的食物傳播。鼠傷寒沙門氏菌為侵襲性細(xì)菌，主要侵犯回腸和結(jié)腸，也可侵犯整個胃腸道。

1.2 臨床剖檢變化

病豬體溫高達(dá) 40.2～41.4 ℃，精神不振、沉郁、寒顫、食欲降低及下痢，糞便惡臭呈灰黃色水樣。眼有黏性分泌物，呼吸困難。一些病豬出現(xiàn)皮膚發(fā)紺，在耳根、胸前、腹下等皮膚出現(xiàn)紫紅色斑點，多數(shù)病例在1～3 d內(nèi)死亡。剖檢可見尸體皮下水腫；皮下有大量出血點；頜下淋巴結(jié)腫大、出血壞死；脾臟腫大，顏色較暗帶藍(lán)，似橡皮，有大量出血點及壞死灶；腸系膜淋巴結(jié)索狀腫大、出血；肝腫大、充血或出血，有的肝實質(zhì)有灰黃色壞死點；腎臟腫大，被膜易剝離，有出血點；胃腸黏膜、漿膜有散在點狀出血；胸腔積液，心包積液。腸管內(nèi)有大量液體蓄積，腸道呈壞死性腸炎，結(jié)腸、盲腸壁增厚，黏膜表面覆蓋一層彌漫性糠麩樣壞死假膜，剝?nèi)ゼ倌た梢娚t、邊緣不規(guī)則的潰瘍面[2]。其中，最典型的特殊病變?yōu)楦闻K布滿灰黃色壞死灶，如圖1。

圖1 豬沙門氏菌病肝臟剖檢變化

2 沙門氏菌的檢測方法

由沙門氏菌引起的中毒病在世界各地的食物中毒病例中所占比例非常高。有資料統(tǒng)計，在我國70%～80%細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門氏菌引起，而由沙門氏菌引起中毒的食品中，約90%是肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品。目前，在進(jìn)行食品質(zhì)量安全監(jiān)控的中國計量認(rèn)證檢測時，沙門氏菌的檢測已成為必檢的衛(wèi)生指標(biāo)之一。傳統(tǒng)的檢測方法是先采用非選擇性和選擇性增菌，然后分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定，檢驗程序十分繁瑣，且腸桿菌科細(xì)菌間的生化反應(yīng)多有交叉，需4～7 d才能完成，因此傳統(tǒng)的檢測方法在快速、敏感與特異性等方面有自身的局限性。隨著分子生物學(xué)及分子細(xì)菌學(xué)的發(fā)展，病原菌分離培養(yǎng)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、PCR等以其迅速、簡便和靈敏等優(yōu)點成為科研和臨床診斷的技術(shù)熱點，已廣泛用于食品中以及臨床樣品和環(huán)境中的沙門氏菌的檢測[3]。

2.1 傳統(tǒng)分離鑒定培養(yǎng)

首先應(yīng)采集病變樣品，病豬取肝臟，糞便，回腸、盲腸或結(jié)腸內(nèi)容物，然后對樣品進(jìn)行沙門氏菌的分離和鑒定，通常包括4個步驟：①預(yù)增菌：將樣品置于營養(yǎng)性培養(yǎng)基中，保證正常和受損的沙門氏菌的存活；②選擇性富集：保證沙門氏菌的生長并抑制其它微生物生長，多采用兩種選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平行試驗；③分離純化：在沙門氏菌選擇性平板上劃線培養(yǎng)，然后挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)；④鑒定：方法主要包括顯微鏡檢查、生化鑒定和血清凝集試驗。將純化后的沙門氏菌進(jìn)行革蘭氏染色，以參考菌株為對照在油鏡下進(jìn)行辨別觀察。然后進(jìn)行生化鑒定試驗，讀取生化鑒定試紙條生化指標(biāo)，判斷是否符合沙門氏菌特性。還可采用診斷血清對純培養(yǎng)菌株進(jìn)行玻片凝集試驗，以無菌生理鹽水為對照，1 min內(nèi)明顯凝集即為陽性，呈均勻渾濁者即為陰性。圖2分別列舉了沙門氏菌分離純化（DHL板）、革蘭氏染色鏡檢（雙側(cè)對稱短桿狀）及生化試驗結(jié)果。

圖2 沙門氏菌傳統(tǒng)分離鑒定方法

目前，有關(guān)動物和動物產(chǎn)品沙門氏菌檢測方法中國現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)為NY/T 550—2002，傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法仍廣泛使用。該方法雖然準(zhǔn)確度高，但耗時長，至少要3 d才能有初步結(jié)果，需要4～7 d才可得到明確的診斷結(jié)果，不夠方便快捷[4]。

2.2 免疫學(xué)方法

由于細(xì)菌存在特征性的菌體抗原或鞭毛抗原，制備相應(yīng)特異性的抗體便可用于快速檢測特定的病原。利用抗體抗原結(jié)合的特異性和免疫放大技術(shù)，可建立十分靈敏的檢測方法。目前，免疫學(xué)方法被廣泛地應(yīng)用于沙門氏菌檢測，主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、斑點酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-ELISA）、免疫熒光標(biāo)記法（FIA）、免疫磁性分離法（IMS）[5]。

2.3 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法采用體外分子探針檢測細(xì)菌核酸某段特異性的序列片段，對探針加以酶標(biāo)、同位素等標(biāo)志物，即可達(dá)到檢測目的。目前主要的技術(shù)方法包括：PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、原位熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)、基因芯片技術(shù)、核酸探針技術(shù)。盤寶進(jìn)等[6]對沙門氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物片段大小為284 bp，引物序列如表1，電泳結(jié)果如圖3。

表1 PCR/RT-PCR引物序列

圖3 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3 沙門氏菌不同血清型間差異與藥敏試驗

沙門氏菌具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般分為菌體O抗原和鞭毛H抗原，極個別的沙門氏菌含有莢膜Vi抗原。目前，根據(jù)Kauffman-White（K-W）血清型分型方法，基于沙門氏菌菌體抗原及鞭毛抗原的差異，可分為2 600種沙門氏菌血清型[7]。O抗原是包含在脂多糖（LPS）中的特異性多糖物質(zhì)，是革蘭氏陰性細(xì)菌的一個重要組成部分。編碼O抗原的基因通常位于染色體上一個稱為rfb的基因簇中，rfb基因參與核普酸糖的生物合成途徑以及重復(fù)單元組件的轉(zhuǎn)移。Wzx基因（即rfb X基因）可編碼一種跨膜蛋白，這種跨膜蛋白由12種跨膜片段組合而成，并存在于所有這些沙門氏菌O抗原基因簇中。不同O抗原簇中的Wzx蛋白具有結(jié)構(gòu)同源性。然而它們在氨基酸序列水平上極少相似[8]。有研究指出，Wzx蛋白的功能就是負(fù)責(zé)把O-單元從細(xì)胞質(zhì)運送到細(xì)胞質(zhì)膜的周質(zhì)側(cè)[9]。另一方面，鞭毛抗原H1和H2分別由fliC基因和fljB基因編碼，這兩個基因的末端都很保守，而在其編碼抗原的中心區(qū)域卻高度可變[10-11]。

人們一直在研究代替或補充傳統(tǒng)血清分型方法的分子檢測方法，如核糖分型[12]、RAPD分子標(biāo)記技術(shù)[13]、IS200分型技術(shù)[14]分析等。隨著人們研究的不斷深入，PCR及其它以核酸為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)在生物學(xué)分類鑒定方面應(yīng)用愈加廣泛，大幅縮短了實驗室檢測時間，而且易于規(guī)范化，對人員要求不高，在一定程度上彌補了傳統(tǒng)鑒定分型方法的不足[15]。施開創(chuàng)等[16]采用MLST預(yù)測及PCR直接測定的方法對沙門氏菌21種常見血清型進(jìn)行鑒定，其中PCR方法是基于編碼不同抗原O抗原、H1抗原和H2抗原的基因設(shè)計的，相較于MLST預(yù)測方法，PCR方法能夠更為準(zhǔn)確、直接地鑒定沙門氏菌血清型，具有耗時少、費用低等優(yōu)點，并能與其它分型方法相結(jié)合，具有更為廣闊的應(yīng)用空間。

藥敏試驗根據(jù)血清型的不同，選用34種沙門氏菌病原進(jìn)行，其中有A群1株、B群15株、C2群1株、D群14株和未定型3株，如表2。

表2 34株沙門氏菌分離株的血清型分析

對已鑒定的34株致病性沙門氏菌分離株采用ATB VET藥敏試劑條法和K-B紙片法進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗，分別通過ATB儀讀取結(jié)果和人工游標(biāo)卡尺測量結(jié)果并進(jìn)行比較分析。由表3可知，34株分離株均對美洛培南、亞胺培南、大觀霉素和安普霉素敏感；對氯霉素、卡那霉素、慶大霉素的耐藥率小于10%，對阿莫西林、鏈霉素、氟甲喹、噁喹酸、磺胺甲噁唑、四環(huán)素和呋喃妥因耐藥率介于50%和90%之間，而對紅霉素、林可霉素、原始霉素、泰洛星、青霉素、苯唑西林、夫西地酸、利福平和甲硝唑的耐藥率達(dá)到100%，耐藥性嚴(yán)重，且存在多重耐藥現(xiàn)象，如表3。

表3 34株沙門氏菌分離株對30種抗菌藥物的敏感性試驗

4 沙門氏菌病的防治

4.1 沙門氏菌病的預(yù)防

沙門氏菌病的預(yù)防措施主要為疫苗接種及日常飼養(yǎng)管理的加強(qiáng)，不建議預(yù)防用藥。在養(yǎng)豬過程中要定期監(jiān)測畜舍中致病沙門氏菌（至少包括腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌）的狀況，有利于避免疾病的暴發(fā)。對于養(yǎng)殖使用的水和飼料同樣需要注意保存，避免沙門氏菌的污染，若檢測結(jié)果為陽性，不可繼續(xù)直接使用。

目前用于預(yù)防畜禽沙門氏菌常見的疫苗分為兩大類：①滅活疫苗：主要包括腸炎沙門氏菌滅活疫苗和鼠傷寒沙門氏菌滅活疫苗[17]；②弱毒活疫苗：多為鼠傷寒沙門氏菌活疫苗、腸炎沙門氏菌活疫苗等。由于弱毒沙門氏菌推薦免疫時間較晚，早期存在免疫缺口，而目前預(yù)防沙門氏菌感染最常用的為弱毒沙門氏菌疫苗。弱毒沙門氏菌是指通過理化、基因工程等方法，使某些與其毒力相關(guān)的基因發(fā)生不可逆突變，達(dá)到降低毒力目的而獲得的沙門氏菌菌株。目前，沙門氏菌弱毒株還多用作疫苗載體攜帶外源基因，隨著弱毒株的增殖不斷表達(dá)相應(yīng)的免疫原性蛋白，從而達(dá)到免疫目的。

目前畜禽養(yǎng)殖中針對沙門氏菌病的預(yù)防主要采用抗菌藥物，而沙門氏菌的感染多伴隨混合感染，養(yǎng)殖戶大多采用廣譜類抗菌藥物，如阿莫西林等抗生素進(jìn)行細(xì)菌病預(yù)防。

4.2 沙門氏菌的治療

目前治療沙門氏菌常見的藥物包括：①新霉素：可用于治療沙門氏菌引起的胃腸道感染，預(yù)混劑以新霉素計混飼給藥，豬77～154 g/1 000 kg飼料；可溶性粉混飲50～75 mg/L水，連續(xù)3～5 d；②土霉素：內(nèi)服單次量，豬10～25 mg/kg體重，一日2～3次，連用3～5 d。③甲砜霉素：內(nèi)服單次量，豬5～10 mg/kg體重，一日2次，連用2～3 d。④黏菌素：混飲，以黏菌素計。豬40～200 mg/L水；混飼，豬（哺乳期）2～40 g/1 000 kg飼料，仔豬2～20 g/1 000 kg飼料。⑤磺胺嘧啶：混飼，單日量，豬 15～30 mg/kg 體重，連用 5 d[18]。在此基礎(chǔ)上，建議養(yǎng)殖戶在治療沙門氏菌感染時，參考病原菌的體外抗生素敏感試驗的結(jié)果進(jìn)行用藥，可有效避免濫用抗菌藥物導(dǎo)致的療效差、治療成本高、產(chǎn)生耐藥性等問題。

[1]謝莉莉，黃舒云.豬副傷寒的診斷及防治[J].中國畜禽種業(yè)，2015（6）：116-117.

[2]何晶，吳凌，王國良，等.仔豬副傷寒的診斷與治療[J].畜禽業(yè)，2008（11）：74-75.

[3]Judy S W,Karen L J,Suresh D P,et al.Specific detection of salmonella spp.by muotiplex polymerase chian reaction[J].Applied and Enviromental Microbiology,1993,59(5)：1473-1479.

[4]楊懷珍，牟亞，羅薇.食源性沙門氏菌的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（7）：69-71.

[5]牛瑞江.沙門氏菌富集及ELISA檢測方法的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2012.

[6]盤寶進(jìn)，韋梅良，汪文龍，等.應(yīng)用二重PCR快速檢測實驗猴沙門氏菌和志賀氏菌[C].中南地區(qū)實驗動物科技交流會論文集，2009.

[7]翟立公.沙門氏菌及其致病性血清型分子檢測技術(shù)研究及在食品中的應(yīng)用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[8]Marolda C L,VicarioliI J,Valvano M A.Wzx proteins involved in biosynthesis of O antigen function in association with the first sugar of the O-specific lipopolysaccharide subunit[J].Microbiology,2004,150(12)：4095-4105.

[9]Samuel G,Reeves P.Biosynthesis of O-antigens：genes and pathways involved in nucleotide sugar precursorsynthesis and O-antigen assembly[J].Carbohydrate Research,2003,338(23)：2503-2519.

[10]Mcquiston J R,Parrenas R,Ortiz-Rivera M,et al.Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fli C,flj B,and flp A from Salmonella[J].Journal of Clinical Microbiology,2004,42(5)：1923-1932.

[11]Joys T M.The covalent structure of the phase-1 flagellar filament protein of Salmonella typhimurium and its com-parison with other flagellins[J].Journal of Biological Chemistry,1985,260(29)：15758-15761.

[12]Estsbane,Snipesk,Hirdd,et al.Use of ribotyping for characterization of Salmonella serotypes[J].Journal of Clinical Microbiology,1993,31(2)：233-237.

[13]Shangkuan Y H,Lin H C.Application of random amplified polymorphic DNA analysis to differentiate strains of Salmonella typhi and other Salmonella species[J].Journal of Applied Microbiology,1998,85(4)：693-702.

[14]Uzzau S,Hovi M,Stocker B A D.Application of ribotyping and IS200 fingerprinting to distinguish the five Salmonella serotype O6,7：c：1,5 groups：Choleraesuissensustricto,Choleraesuis var.Kunzendorf,Choleraesuis var.Decatur,Paratyphi C and Typhisuis[J].Epidemiology and Infection,1999,123(1)：37-46.

[15]Abubakar I,Irvine L,Aldus C F,et al.A systematic review of the clinical,public health and cost-effec-tiveness of rapid diagnostic tests of the detection and identification of bacterial intestinal pathogens in faeces and food[J].Health Technol Assess,2007,11(36)：1-216.

[16]施開創(chuàng)，李鳳梅，鄒聯(lián)斌，等.雞源致病性沙門氏菌的分離鑒定及血清型和藥物敏感性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（8）：2160-2168.

[17]Jawale C V,Lee J H.Characterization of adaptive immune responses induced by a new genetically inactivated Salmonella Enteritidis vaccine[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2014,37(3)：159-167.

[18]中國獸藥典委員會.中國獸藥典-獸藥使用指南（化學(xué)藥品卷）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：366-369，20-22，58-61，371-372，446-451.