姚 晶，王科文

[碩騰（上海）企業(yè)管理有限公司，上海 長寧 200050]

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV，俗稱藍(lán)耳病病毒）是引起全球養(yǎng)豬行業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的病原之一。PRRSV每年給美國養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)10億美元以上[1]，按照此標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)中國每年因PRRSV造成的損失大約為50億美元以上（中國出欄量為美國的5倍多）。然而，控制和凈化PRRSV的關(guān)鍵一步是切斷PRRSV在種豬群的循環(huán)，如此養(yǎng)豬生產(chǎn)體系才能生產(chǎn)出藍(lán)耳病斷奶陰性仔豬[2]。因此，有效地監(jiān)測種豬群的PRRSV感染狀況（母豬感染狀況分類）對評估藍(lán)耳?。≒RRS）控制與凈化效果是非常必要的。例如在PRRSV凈化項(xiàng)目中，評估其進(jìn)展通用的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是斷奶仔豬檢不出病毒所需要的時(shí)間。

在過去幾年里，隨著采樣方法和診斷技術(shù)的不斷改進(jìn)，豬場樣品采集工作變得更加便捷。當(dāng)前養(yǎng)豬行業(yè)對哺乳仔豬PRRSV的監(jiān)測主要為血清混合樣本檢測，但是，在低感染率的情況下，哺乳仔豬血清混合樣本對PRRSV循環(huán)的檢測敏感性較低。為了提高種豬群PRRSV的檢出率，養(yǎng)豬行業(yè)需要一個(gè)更好的檢測方法。這種檢測方法在保證準(zhǔn)確性、可操作性以及成本低的情況下，檢測的樣本量更大、檢測更頻繁。因此，先是發(fā)展了更為方便可靠的口腔液樣本采集檢測法，該方法目前多是用在生長肥育豬以及種豬群樣本的采集，而在哺乳仔豬上的使用比較少。然而，獸醫(yī)和生產(chǎn)者仍然不斷地追求更敏感、更便宜、更快的樣本采集方法。最近又提出了一種樣本采集新方法，即處理液（日常仔豬處理時(shí)斷尾、公豬閹割濾出的液體，通常在7日齡內(nèi)）樣本的采集法，處理液樣本采集法可以滿足人們對檢測方法敏感、低成本、快捷的需求。

本文將主要介紹口腔液樣本檢測法和組織液檢測法在哺乳仔豬監(jiān)測PRRSV帶毒情況的最新研究進(jìn)展。

1 母豬場PRRSV感染狀態(tài)分類的重要性及其采樣檢測方法的調(diào)查

美國明尼蘇達(dá)大學(xué) MSHMP項(xiàng)目（Morrison Swine Health Monitoring Program）對母豬PRRS感染狀態(tài)分類的重要性及其采樣檢測方法進(jìn)行了調(diào)查[3]。該調(diào)查的對象為美國13生產(chǎn)體系的21位獸醫(yī)工作者（這些獸醫(yī)們服務(wù)的母豬群約為150萬）。其中12/21（57%）和8/21（38%）的獸醫(yī)分別認(rèn)為母豬群感染狀態(tài)的分類非常重要和重要，只有1位獸醫(yī)認(rèn)為其不重要。另一方面，對他們采取采樣檢測方法的調(diào)查結(jié)果表明，他們更多的是采用哺乳仔豬血液樣本進(jìn)行檢測（17/21，81%），其次是采用處理液樣本（11/21，52%）；一些獸醫(yī)們在采集哺乳仔豬血液的同時(shí)，也采集處理液樣本進(jìn)行組合檢測（8/21，38%）；而單純使用哺乳仔豬血液樣本進(jìn)行檢測的獸醫(yī)比例為33%（7/21）；具體調(diào)查結(jié)果見圖1[3]。從圖1可以看出，主要的采樣檢測樣本為哺乳仔豬血樣和處理液樣本，其次是母豬血樣和口腔液樣本（包括母仔口腔唾液）。雖然，調(diào)查結(jié)果表明哺乳仔豬血液樣本采集比例仍然是很高，但是其作為傳統(tǒng)的藍(lán)耳病監(jiān)測方法不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢，而且還會(huì)引起仔豬應(yīng)激甚至死亡。

圖1 PRRS感染狀態(tài)分類所采集不同樣本的調(diào)查

2 口腔唾液（Oral fluids）樣本的檢測

目前有較多關(guān)于口腔唾液樣本檢測的文獻(xiàn)報(bào)道。相對于費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢的血液樣本，口腔唾液樣本是一種成本效益好的、動(dòng)物福利好的替代基于血清的監(jiān)測樣本。很多病原均可以在豬的口腔液中檢測到，比如圓環(huán)病毒2型[4]、豬流感病毒[5]以及豬丹毒桿菌[6]等；在PRRSV方面，也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了相關(guān)研究[7-9]。目前，很多研究均表明基于口腔唾液的PRRSV監(jiān)控在豬場是很實(shí)用的，因?yàn)榭谇煌僖簶颖静杉奖慵捌湓\斷方法優(yōu)化也方便。

雖然在生長肥育豬以及成年豬采集口腔唾液已經(jīng)有很多相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但是在采集哺乳仔豬口腔唾液方面的文獻(xiàn)報(bào)告卻很少。那么采集哺乳仔豬口腔唾液樣本來監(jiān)控母豬群PRRSV感染狀況是否可行呢？

Graham等（2013）檢測了一個(gè)豬群斷奶前仔豬血樣（44窩仔豬，共454份仔豬血樣）以及每窩的口腔唾液樣本；檢測結(jié)果表明有兩窩仔豬為PRRSV陽性，其中一窩里面只有1頭仔豬血樣為PRRSV陽性，而另一窩里面有2頭仔豬血樣為PRRSV陽性[10]；同樣，Cano等（2008）對42窩仔豬的口腔唾液進(jìn)行RT-PCR檢測，其中檢出13窩仔豬為PRRSV陽性；這13窩仔豬中有8窩包含有1頭PRRSV陽性仔豬，2窩包含有2個(gè)PRRSV仔豬陽性，3窩包含有4頭以上仔豬PRRSV陽性[11]。

雖然口腔唾液采樣法是非常方便、快捷、低成本并可靠的采樣方法，但是從哺乳仔豬獲取口腔唾液樣本并不是那么容易?？谇灰旱臋z測在生長豬以及成年豬（公豬、后備豬以及經(jīng)產(chǎn)母豬）已經(jīng)得到了成功的探索，而針對如何更好地獲取哺乳仔豬口腔唾液的相關(guān)數(shù)據(jù)較少。

Marcelo等[12]在建立哺乳仔豬口腔唾液成功收集的標(biāo)準(zhǔn)流程方面作相關(guān)的研究。他們探索了不同采樣方式[母仔共用唾液采集繩（Family oral fluids）和只有仔豬有采集繩]、采集繩中加不同誘食劑、不同采樣時(shí)間以及不同繩子長度情況下，口腔唾液樣本的成功采集率（最終收集到的唾液體積在0.5毫升以上）；經(jīng)過他們的試驗(yàn)最終在提高采集哺乳仔豬口腔唾液樣本成功率方面提出如下建議：1）仔豬日齡。3周齡以上仔豬比低日齡哺乳仔豬的采集成功率更高。2）采集時(shí)間。采集時(shí)間越早，成功率越高（最好在早上6：00之前）。3）不同采樣方式。相對于只有仔豬能咬到采集繩，母仔共用采集繩明顯可以提高采集樣品的成功率；母豬起到教導(dǎo)的作用。4）誘食劑。在采集繩上涂花生醬略微地改善采集成功率。5）繩子高度。越靠近地板越容易采集到唾液樣本。6）采集前訓(xùn)練仔豬。采集樣本前訓(xùn)練哺乳仔豬可以提高樣本采集成功率。

同時(shí)Marcelo等[12]比較了72窩母仔口腔唾液和窩內(nèi)所有仔豬單個(gè)血清樣本（699份）之間PRRSV rRT-PCR檢測結(jié)果，最終檢測結(jié)果顯示血清樣本陽性率為 24.6%（172/699），而將近一半窩數(shù)[44.4%（32/72）]仔豬中至少有1頭PRRSV陽性仔豬；這32窩仔豬的母仔口腔唾液的陽性率為84.4%（27/32）；其中窩里含有3頭或以上的PRRSV陽性仔豬的母仔口腔唾液也均為陽性，而窩里只有1頭或2頭的PRRSV陽性仔豬母仔口腔唾液陽性率為50%。因此，母仔口腔唾液的PRRSV核酸檢測也可以很好地（成本低、更頻繁、更多樣本）用于哺乳仔豬PRRSV的監(jiān)控。

3 采用處理液（Processing fluids）樣本監(jiān)測母豬群PRRSV感染狀況

首先，處理液樣本的定義為仔豬閹割和剪尾處理后的睪丸、尾巴等組織滲出液的混合樣本。因?yàn)樵缫延醒芯勘砻鱌RRSV可以在睪丸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞里復(fù)制[13]，所以從理論上來講處理液可能是PRRSV監(jiān)控的合適樣本。目前已有一些研究表明處理液可以很好地作為監(jiān)測PRRSV的樣本。

美國MSHMP項(xiàng)目在2017年發(fā)表相關(guān)研究課題，評估了處理液熒光定量PCR檢測PRRSV來評估母豬群PRRSV感染狀態(tài)的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，處理液是一種用于檢測哺乳仔豬PRRSV非常敏感有效的樣本（只要有1頭PRRSV陽性豬的處理組織在樣本中，處理液的檢測結(jié)果即能檢出陽性），而且低胎次（1～2胎）母豬和高胎次（2胎以上）母豬之間存在顯著差異，低胎次母豬陽性率更高。

Lopez等初步研究表明，與單個(gè)血清樣本合樣和尾巴血液拭子相比，處理液具有更高的PRRSV檢出率[14]。處理液的檢出率為66%（21/32），而對應(yīng)的單個(gè)樣本（血清和尾巴血拭子）合樣具有更低的檢出率，為31%（10/32）；豬場員工采集處理液操作起來更方便，采樣成功率為100%，而且采集樣本量足夠進(jìn)行多個(gè)檢測。他們從18個(gè)陽性樣本中獲得15個(gè)PRRSV基因序列，這也說明PRRSV RNA在處理液里相對比較穩(wěn)定，而且有很高的核酸量。

此外，處理液由閹割和斷尾處理過程生成，那么這兩種不同的處理液對PRRSV的檢出率是否會(huì)有不一樣呢？Hood等對比了使用睪丸和尾巴制成的兩種處理液藍(lán)耳的監(jiān)測情況。他們選取了北卡羅萊納州（美國東南部）7個(gè)不同的母豬場作為研究試驗(yàn)場，而且這些場都經(jīng)過血清學(xué)診斷為PRRS不穩(wěn)定豬場；每種處理液各采集了32份樣品，用熒光定量PCR的檢測方法檢測，并分析其Ct值（循環(huán)閾值）；最終結(jié)果表明，睪丸處理液的檢出率（53.1%）比斷尾處理液（31.3%）高，而且睪丸處理液的Ct值比斷尾處理液明顯要低（說明病毒核酸含量更高）[15]。

PRRSV在豬群越來越穩(wěn)定的時(shí)候，感染率也是越來越低，那么對于這種感染率低的豬群是否也能夠很好地檢測出來呢？Jacob等做了一些研究來探索很低感染率的情況下的處理液的檢出率：首先他選取了已知PRRSV陽性的豬場并采集尾巴和睪丸處理液，同時(shí)采集已知PRRSV陰性豬場并采集其處理液（10窩1組，多組，PCR確定陰性）；然后將1份PRRSV 陽性處理液（Ct 22.06） 置于 10、20、30、40、50窩PRRSV陰性處理液中，取每個(gè)稀釋度樣本去做PCR檢測；所有的PCR檢測結(jié)果均為陽性；另外將1份不同Ct值的 PRRSV陽性處理液（Ct 33.56）做類似的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)前面4個(gè)稀釋度都是陽性，而50窩稀釋度為PRRSV陰性。因此從其研究結(jié)果可看出，即使在非常低的流行率情況下，仍然能夠檢測出來PRRSV；但是Ct值也是會(huì)影響PRRSV的檢出率的[16]。

因此，基于處理液的樣本采集是篩查豬群藍(lán)耳病的一個(gè)簡單、快速、有效方法；豬場在進(jìn)行PRRSV監(jiān)控時(shí)，采集處理液判斷豬群生產(chǎn)的仔豬是否到達(dá)陰性。當(dāng)豬場持續(xù)監(jiān)測到PRRSV循環(huán)（陽性處理液）時(shí)，警示豬場管理者和員工采取進(jìn)一步管理措施阻止病毒在豬群的循環(huán)，避免PRRSV在豬群的進(jìn)一步傳播。

[1]Holtkamp D J,Kliebenstein J B,Neumann E J,et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers[J].J Swine Heal Prod,2013,21(2)：72-84.

[2]Corzo C A,Mondaca E,Wayne S,et al.Control and elimination of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus Res,2010,154(1-2)：185-192.

[3]Sanhueza J M,Vilalta C,Geary E,et al.Sow farm PRRS status classification survey[J].Morrison Swine Health Monitoring,2018,04.06.https：//z.umn.edu/SciencePages

[4]Prickett J R,Johnson J,Murtaugh M P,et al.Prolonged detection of PCV2 and anti-PCV2 antibody in oral fluids following experimental inoculation[J].Transbound Emerg Dis,2011,58：121-127.

[5]Panyasing Y,Goodell C K,Wang C,et al.Detection of influenza A virus nucleoprotein antibodies in oral fluid specimens from pigs infected under experimental conditions using a blocking ELISA[J].Transbound Emerg Dis,2014,61(2)：177-184.

[6]Gimenez-Lirola L G,Xiao C T,Zavala M,et al.Improving ante mortem diagnosis of erysipelothrix rhusiopathiae infection by use of oral fluids for bacterial,nucleic acid,and antibody detection[J].J Microbiol Methods,2013,92：113-121.

[7]Kittawornrat A,Prickett J,Chittick W,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in serum and oral fluid samples from individual boars：will oral fluid replace serum for PRRSV surveillance?[J].Virus Res,2010,154：170-176.

[8]Prickett J,Simer R,Christopher-Hennings J,et al.Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples：a longitudinal study under experimental conditions[J].J Vet Diagn Invest,2008a,20,156-163.

[9]Prickett J,Simer R,Yoon K J,et al.Surveillance of commercial growing pigs for PRRSV and PCV2 infections using pen-based oral fluid samples：a pilot study[J].Swine Health Prod,2008b,16：86-91.

[10]Graham J,Rademacher C,Swalla R.Use of oral fluid sampling in suckling pigs for PRRSV monitoring[C].Proceedings Seminar of American Association of Swine Veterinarians,San Diego,CA,2013：83-89.

[11]Cano J P,Dee S A,Rovira A,et al.PRRSV vertical transmission dynamics in an endemically infected sow-herd[C]//In：Proceedings Seminar of American Association of Swine Veterinarians,San Diego,CA,2008：105.

[12]Marcelo A,Jeffrey Z,Derald H,et al.Comparative evaluation of family oral fluids and piglet sera to detect PRRSV RNA by PCR[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：339.

[13]Sur J H,Doster A R,Christian J S,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus replicates in testicular germ cells,alters spermatogenesis,and induces germ cell death by apoptosis[J].J Virol,1997,71(12)：9170-9179.

[14]Will A,Jose A,Clayton J,et al.Processing fluids for PRRSV monitoring and surveillance systems[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：61.

[15]Hood M,S Hough,J.Angulo,et al.Comparison of the use of tails versus testicles in the production of processing fluids for detection of PRRSV[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：99.

[16]Jacob B,Deb M,Amanda S,et al.Utilizing piglet-processing fluids to detect PRRSV by PCR in a low-prevalence population[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：95.