李慶崗，王重龍，楊家軍，吳義景，錢 坤

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031；2.豬分子數(shù)量遺傳學(xué)安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

定遠(yuǎn)豬、圩豬、安慶六白豬、皖南黑豬和皖南花豬均為安徽優(yōu)良的地方品種資源，長(zhǎng)期的自然選擇逐漸形成了其繁殖性能好、肉質(zhì)佳、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但其生長(zhǎng)速度慢、飼料報(bào)酬低、瘦肉率低，使其飼養(yǎng)成本過高，銷售價(jià)格低，導(dǎo)致各品種純種數(shù)量銳減，特有的生物學(xué)特征逐漸減弱或丟失，生物多樣性日益匱乏。在國家和當(dāng)?shù)卣墓餐ο拢髌贩N建立起了保種場(chǎng)，其中定遠(yuǎn)豬和安慶六白豬為國家級(jí)保種場(chǎng)，其余品種為省級(jí)保種場(chǎng)。巴克夏、杜洛克、皮特蘭、大約克夏和長(zhǎng)白是當(dāng)前世界主要的瘦肉型豬種，在生長(zhǎng)速度、瘦肉率、飼料報(bào)酬方面均優(yōu)于我國地方豬種，這些瘦肉型豬及其雜交商品豬能夠較快地提供大量瘦肉產(chǎn)品，滿足全國普通豬肉市場(chǎng)的需求，從而解決了人們吃肉問題。隨著人們生活水平的提高，對(duì)豬肉的質(zhì)量提出了更高的要求，為了適應(yīng)當(dāng)前豬肉多元化市場(chǎng)，地方品種豬是一種不可或缺的寶貴資源，切實(shí)保護(hù)這些地方豬種資源，對(duì)于安徽養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義。

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記是20世紀(jì)80年代末期發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記，具有多態(tài)信息含量豐富、共顯遺傳、高度保守、易于檢測(cè)等特點(diǎn)，被國內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用畜禽和瀕危、稀有動(dòng)物的遺傳多樣性分析、品種間遺傳距離估測(cè)及群體遺傳分化關(guān)系的研究[1]。近年來，國內(nèi)學(xué)者采用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)中國地方豬種的遺傳多樣性現(xiàn)狀做了大量的研究和探討[2-5]，但涉及引進(jìn)品種和安徽省地方品種的研究較少。本研究應(yīng)用30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了5個(gè)安徽地方豬品種和5個(gè)引進(jìn)品種的群體遺傳多樣性及遺傳分化關(guān)系，為弄清地方豬品種和引進(jìn)品種的遺傳變異程度、品種間遺傳關(guān)系、開展下一步品種資源的保護(hù)和利用工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

采用隨機(jī)采樣法分別采集安徽省5個(gè)地方豬品種和5個(gè)引進(jìn)品種的血樣，并于-20℃保存。各個(gè)豬品種的樣品數(shù)及采樣地點(diǎn)見表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物品種和樣本數(shù)及采樣地點(diǎn)

1.2 引物

共選擇30個(gè)豬微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，分別位于豬的17條常染色體和X染色體上，均由上海生工生物工程公司合成，其引物信息、所在染色體位置及擴(kuò)增長(zhǎng)度范圍見表2。

1.3 基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增

采用酚-仿法抽提血液基因組DNA，經(jīng)濃度檢測(cè)后，DNA濃度稀釋至100 ng/μL，用于PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×PCR MIX 10 μL、模板DNA 1 μL、上游和下游引物（10 pmol/L）各 0.5 μL、雙蒸水8 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s、50～60℃退火（不同引物退火溫度不同）30 s、72℃延伸30 s（35個(gè)循環(huán)）；72℃延伸4 min。

1.4 毛細(xì)管電泳分型

根據(jù)PCR片段的遷移率差異性，將PCR產(chǎn)物在3730測(cè)序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，進(jìn)行精細(xì)分離，測(cè)序儀掃描熒光信號(hào)生成測(cè)序圖譜文件abi，利用GeneMapper軟件（v3.2.1）對(duì)圖譜進(jìn)行分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析方法

采用Popgene32軟件對(duì)10個(gè)豬群體的30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳相似系數(shù)、Nei's遺傳距離進(jìn)行計(jì)算，基于Nei's遺傳距離應(yīng)用NTSYSPC 2.10e軟件中的非加權(quán)分組平均法（UPGMA法）對(duì)10個(gè)豬種進(jìn)行聚類分析并作圖。

表2 30個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 10個(gè)品種的遺傳多樣性

30個(gè)微衛(wèi)星座位在測(cè)定的10個(gè)豬種總?cè)后w中均表現(xiàn)為高度多態(tài)位點(diǎn)?？傆^察等位基因數(shù)380，平均為12.666 7；觀察等位基因數(shù)最少為S0155、S0026和SW72座位的7，最多為S0002座位的24；總有效等位基因數(shù)為183.944 9，平均為6.131 5，最少為S0218座位的3.073 3，最多為SW1067座位的11.6091；多態(tài)信息含量在0.672 1～0.912 7之間，平均多態(tài)信息含量為0.815 5（表3），多態(tài)信息含量豐富，可用于群體遺傳多樣性分析。

2.2 品種內(nèi)的遺傳多樣性

由表4可以看出，10個(gè)豬種的平均觀察等位基因數(shù)范圍為3.466 7～7.200 0，安徽地方品種豬平均觀察等位基因數(shù)（6.120 0）高于引進(jìn)品種（4.406 7）；平均有效等位基因數(shù)最多的為安慶六白豬（4.513 1），最少的為巴克夏（2.274 2），安徽地方品種的平均有效等位基因數(shù)（3.729 4）高于引進(jìn)品種（2.684 9）。觀察雜合度和期望雜合度范圍分別為0.493 5～0.747 5和0.496 3～0.777 7；地方品種的平均觀察雜合度和平均期望雜合度分別為0.683 1和0.704 9，高于引進(jìn)品種的0.570 1和0.574 9；多態(tài)信息含量范圍為0.466 8～0.750 4，地方品種多態(tài)信息含量（0.687 2）高于引進(jìn)品種（0.554 3）。地方品種屬于高度多態(tài)，引進(jìn)品種中除巴克夏為中度多態(tài)外，其余品種為高度多態(tài)。

2.3 哈德-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡檢測(cè)

對(duì)10個(gè)豬品種的30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明，定遠(yuǎn)豬中除 SW857、SW2406、SW24、S0097、S0090、S0068和 S0005 之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)；圩豬中除 SW2406、SW240、SW1067、S0335、S0218、S0155和 S0005 之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)；安慶六白豬中除SW2406和S0101之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)外；皖南黑豬中除 SW911、SW2406、SW632、SW1828、SW24、S0143、S0178和S0090之外，其余各位點(diǎn)均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)；皖南花豬中除S0026、SW72、SW2008、SW2406、SW632、SW122、SW830、SW24、S0218、S0068之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)；巴克夏中除SW830和S0228之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)；杜洛克中除SW2406、SW24、S0218之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)；皮特蘭中除S0002、SW1941、SW240、SW830和S0101之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)；大約克夏中除SW2410、SW1828和SW1941之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)；長(zhǎng)白中除SW936、SW72、SW2406、SW1828、SW24、S0218和S0090之外，均處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)。

表3 30個(gè)微衛(wèi)星座位的觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量

表4 10個(gè)豬品種的等位基因數(shù)、雜合度及多態(tài)信息含量

2.4 遺傳分化關(guān)系

分別對(duì)5個(gè)地方品種和5個(gè)引進(jìn)品種進(jìn)行F-統(tǒng)計(jì)量分析，結(jié)果見表5。由表5可知，5個(gè)地方品種的每個(gè)品種內(nèi)所有位點(diǎn)的亞群體的固定指數(shù)（Fis）平均值為0.011 7，5個(gè)引進(jìn)品種的平均Fis值為-0.007 1，說明引進(jìn)品種內(nèi)基本不存在近交。地方品種和引進(jìn)品種的平均全群固定指數(shù)（Fit）值分別為0.159 8和0.214 3，引進(jìn)品種較地方品種偏離隨機(jī)交配的程度較大。5個(gè)地方品種的遺傳分化系數(shù)（Fst）變化范圍在 0.059 1～0.239 4，平均值為 0.149 8；5個(gè)引進(jìn)品種的遺傳分化系數(shù)（Fst）范圍為0.113 1～0.407 5，均值為0.219 8，引進(jìn)品種間差異要大于地方品種間的差異。地方品種和引進(jìn)品種的基因流（Nm）平均分別為1.418 7和0.887 3，說明5個(gè)地方品種間的基因交流程度高于5個(gè)引進(jìn)品種。

表5 5個(gè)地方品種和5個(gè)引進(jìn)品種群體間的F統(tǒng)計(jì)量及基因流

2.5 品種間遺傳距離和聚類分析

10個(gè)品種的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)見表6。由表6可知，10個(gè)品種之間的遺傳距離在0.341 4～1.628 6之間，大約克夏與杜洛克的遺傳距離最?。?.341 4），巴克夏與皖南花豬的遺傳距離最大（1.628 6）。遺傳相似系數(shù)在 0.196 2～0.710 8 之間，與遺傳距離呈反比，品種間遺傳距離越小，遺傳相似系數(shù)越大；遺傳距離越大，遺傳相似系數(shù)也越小。地方品種中的圩豬和安慶六白豬的遺傳相似系數(shù)最高（0.639 9），圩豬和皖南花豬的遺傳相似系數(shù)最低（0.402 6）；引進(jìn)品種中巴克夏與長(zhǎng)白的遺傳相似系數(shù)最低（0.398 8），杜洛克與大約克夏的遺傳相似系數(shù)最高（0.710 8）?；贜ei's遺傳距離的聚類圖見圖1。由圖1可知，10個(gè)品種被聚為兩大分支，一支為安徽5個(gè)地方品種（Ⅰ），一支為5個(gè)引進(jìn)品種（Ⅱ）；Ⅰ支又分為兩個(gè)小支，即Ⅰa和Ⅰb，Ⅰa包含定遠(yuǎn)豬、圩豬和安慶六白豬；Ⅰb包含皖南黑豬和皖南花豬；Ⅰa又分為兩個(gè)小支，分別為Ⅰa1和Ⅰa2，Ⅰa1包含定遠(yuǎn)豬，Ⅰa2包括圩豬、安慶六白豬。Ⅱ支分為兩個(gè)小支，分別為Ⅱa和Ⅱb，Ⅱa包含定遠(yuǎn)豬巴克夏、大約克夏、杜洛克和長(zhǎng)白豬；Ⅱb只包含皮特蘭；Ⅱa中又被分為兩支，分別為Ⅱa1和Ⅱa2，Ⅱa1只包含巴克夏，Ⅱa2包含大約克夏、杜洛克和長(zhǎng)白；Ⅱa2又分為兩個(gè)支，長(zhǎng)白單獨(dú)為一支，大約克夏和杜洛克聚為一支。

表6 10個(gè)豬品種間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

圖1 10個(gè)豬種基于Nei's遺傳距離的聚類情況

3 討論

3.1 遺傳多樣性

有效等位基因數(shù)、期望雜合度和多態(tài)信息含量是反映群體遺傳多樣性的3個(gè)重要指標(biāo)，表示等位基因在群體中分布的均勻程度。相同座位在不同豬品種中，其遺傳變異程度不一，這可能與微衛(wèi)星座位的特性、所研究品種及品種的樣本含量有關(guān)。如張桂香等研究的56個(gè)地方品種豬和3個(gè)引進(jìn)豬種的有效等位基因、期望雜合度和多態(tài)信息含量范圍分別為 2.12～9.03、0.44～0.87、0.39～0.86 和 2.89～4.42、0.52～0.71、0.44～0.6[2]，陳祥等研究的貴州 5 個(gè)地方品種分別為 1.737 7～2.647 1、0.464 7～0.614 6、0.404 2～0.503 0[3]，白小青等研究的重慶5個(gè)地方品種分別為 9.493 3～11.028 0、0.889 7～0.903 2、0.868 9～0.892 6[4]，樊斌研究的二花臉、藏豬、香豬、五指山豬和滇南小耳 豬 分 別 為 2.571 ～3.435、0.553 ～0.661 和 0.522 ～0.649[5]。本研究中，30個(gè)座位在安徽地方品種中的有效等位基因數(shù)、期望雜合度、多態(tài)信息含量（3.729 4、0.704 9、0.687 2）均高于引進(jìn)品種（2.684 9、0.574 9、0.554 3），這與張桂香等[2]研究的中國 56 個(gè)地方豬種遺傳變異顯著高于3個(gè)引進(jìn)豬種（杜洛克、長(zhǎng)白和大約克夏）的結(jié)果一致。多態(tài)信息含量＞0.5時(shí)，該基因座位為高度多態(tài)基因座位；當(dāng)多態(tài)信息含量在0.25～0.5時(shí)，為中度多態(tài)基因座位；當(dāng)多態(tài)信息含量＜0.25時(shí)，則為低度多態(tài)基因座位[6]。本研究中的10 個(gè)品種多態(tài)信息含量為 0.466 8～0.750 4，其中 5個(gè)地方品種多態(tài)信息含量均為高度多態(tài)，引進(jìn)品種中除巴克夏為中度多態(tài)以外，其余4個(gè)品種均為高度多態(tài)。張桂香等研究的圩豬和皖南花豬的有效等位基因、期望雜合度、多態(tài)信息含量分別為6.80、0.83、0.81 和 5.25、0.76、0.74[2]，均高于本研究中的圩豬和皖南花豬，這可能是因?yàn)樗捎玫奈⑿l(wèi)星標(biāo)記數(shù)目和采集樣本的地點(diǎn)不同所造成的。

3.2 群體內(nèi)的遺傳平衡

當(dāng)一個(gè)物種種群足夠大、種群個(gè)體間隨機(jī)交配、沒有突變、沒有選擇、沒有遷移、沒有遺傳漂變的情況下，其基因頻率和基因型頻率保持不變，遵循哈德-溫伯格遺傳定律。本研究中5個(gè)地方品種中安慶六白豬、定遠(yuǎn)豬、圩豬、皖南黑豬和皖南花豬分別有 2、7、7、8、10 個(gè)微衛(wèi)星座位處于不平衡狀態(tài)；5 個(gè)引進(jìn)品種中巴克夏、杜洛克、皮特蘭、大約克夏和長(zhǎng)白分別為 2、3、5、3、7 個(gè)微衛(wèi)星座位處于不平衡狀態(tài)，表明安徽5個(gè)地方品種較引進(jìn)品種偏離哈德-溫伯格平衡的座位多，表明地方品種群體內(nèi)近交程度較引進(jìn)品種高。各地方品種的采樣地點(diǎn)由于群體規(guī)模較小，血統(tǒng)數(shù)量有限，又沒有外血引入，難免會(huì)造成一定程度的近交；而引進(jìn)品種也存在一定的近交水平，可能是因?yàn)椴蓸拥姆秶〉脑颉?/p>

3.3 豬群間的遺傳分化

F-統(tǒng)計(jì)量是群體間遺傳分化程度和近交程度的衡量指標(biāo)，包括亞群體的固定指數(shù)（Fis）、總?cè)后w的固定指數(shù)（Fit）和亞群體間的基因分化系數(shù)（Fst）[7]。本研究中，5個(gè)地方品種和5個(gè)引進(jìn)品種所有位點(diǎn)的平均 Fis、Fit值分別為 0.011 7、0.159 8和-0.007 1、0.214 3，表明全群偏離隨機(jī)交配的程度大于群體內(nèi)每個(gè)品種的程度，引進(jìn)品種較地方品種偏離較大。地方品種內(nèi)偏離隨機(jī)交配的程度較小，仍存在一定程度的近交，而引進(jìn)品種內(nèi)基本不存在近交。Fst小于0.05時(shí)基本無遺傳分化[8]，廣西3個(gè)地方豬種[9]和重慶5個(gè)地方豬種[4]的Fst均小于0.05，而本研究中5個(gè)地方品種和引進(jìn)品種的Fst平均分別為0.149 8和0.219 8，表明安徽5個(gè)地方品種間和5個(gè)引進(jìn)品種間均存在遺傳分化，且引進(jìn)品種分化程度大于地方品種?；蛄鳎∟m）大于1.0時(shí)，能有效抑制由遺傳漂變引起的遺傳分化[10]，本研究中5個(gè)安徽地方品種和5個(gè)引進(jìn)品種的基因流（Nm）平均分別為1.418 7和0.887 3，而貴州5個(gè)地方品種和四川3個(gè)藏豬類群的Nm分別為1.612 7[3]和1.543 2[11]，與安徽5個(gè)地方品種較接近，均能抵制群體間的遺傳漂變，而引進(jìn)品種小于1.0，可能存在一定的遺傳漂變。

3.4 聚類分析

遺傳距離和聚類分析表明，5個(gè)地方品種被分為2大類，一類是皖南花豬和皖南黑豬；另一類是安慶六白豬、圩豬和定遠(yuǎn)豬，其中安慶六白豬和圩豬又被分為一小類（地方品種中遺傳距離最短）；與區(qū)域劃分基本一致，皖南花豬和皖南黑豬分布于皖南山區(qū)（二者親緣關(guān)系較近），安慶六白豬、圩豬分布于長(zhǎng)江兩岸的安徽中部地區(qū)（二者親緣關(guān)系較近），定遠(yuǎn)豬分布于江淮之間（安徽中部偏北），與安慶六白豬、圩豬具有較近的親緣關(guān)系。5個(gè)引進(jìn)品種中首先是杜洛克與大約克夏聚為一類（遺傳距離最短），再分別與長(zhǎng)白、巴克夏聚在一起，最后與皮特蘭聚在一起。5個(gè)地方品種與5個(gè)引進(jìn)品種分別聚為一大類。

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