田豐 于闖 付雙軍 南麗麗

摘要：為了解不同紅豆草材料在越冬期根系對低溫脅迫的響應(yīng)特征及其抗寒性強(qiáng)弱，以7份紅豆草（5份來自俄羅斯、2份來自國內(nèi)）為供試材料，對紅豆草根系可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、脯氨酸（Pro）含量、丙二醛（MDA）含量、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性等6項(xiàng)生理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了監(jiān)測。結(jié)果表明，供試紅豆草材料根系可溶性糖含量（WWS）、可溶性蛋白質(zhì)含量（SP）和脯氨酸含量及CAT活性和POD活性均隨著氣溫下降而增加，隨氣溫升高而減少，MDA含量呈下降趨勢。經(jīng)抗寒隸屬度分析，得出其抗寒性由大到小的順序?yàn)閆XY2003p-132、ZXY2010p-7369、蒙農(nóng)紅豆草、甘肅紅豆草、ZXY2003p-147、ZXY2005p-623、ZXY2007p-3423。從俄羅斯引進(jìn)的紅豆草材料ZXY2003p-132和ZXY2010p-7369比國內(nèi)紅豆草品種蒙農(nóng)紅豆草、甘肅紅豆草抗寒性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：紅豆草；種質(zhì)資源；生理生化；抗寒性

中圖分類號：S541；Q945.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）10-0021-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.10.008

Physiological Response of 7 Onobrychis viciifolia on Low Temperature and

Its Evaluation of Cold Resistance

TIAN Feng 1，2，3，4， YU Chuang1，2，3，4， FU Shuangjun1，2，3，4， NAN Lili1，2，3，4

（1. College of Pratacultural Science， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070，China；2. Key Laboratory of Grassland Ecosystem of Ministry of Education， Lanzhou Gansu 730070， China；3. Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province，Lanzhou Gansu 730070， China；4. Sino-U. S. Centers for Grazing land Ecosystem Sustainability， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to understand the response characteristics and cold resistance of different Onobrychis viciifolia cultivars to low temperature stress during overwintering， with 7 Onobrychis viciifolia cultivars （5 from Russia and 2 from China） being used as material， the dynamic changes of 6 physiological indexes in the roots of Onobrychis viciifolia were monitored， such as the contents of soluble sugar， soluble protein， proline （Pro） and malondialdehyde （MDA）， activity of catalase （CAT） and peroxidase （POD） activity. The results showed that the soluble sugar content （WWS）， soluble protein content （SP）， proline content， CAT activity and POD activity of roots of Onobrychis viciifolia increased with the decrease of air temperature， but decreased with the increase of air temperature， the content of MDA showed a downward trend. According to the analysis of the degree of Cold resistance subordination， the order of cold resistance from large to small was ZXY2003p-132， ZXY2010p-7369， Onobrychis viciaefolia. Scop. cv. Mengnong， Onobrychis viciaefolia. Scop. cv. Gansu， ZXY2003p-147， ZXY2005p-623， ZXY2007p-3423. The materials of Onobrychis viciifolia XY2003p-132 and ZXY2010p-7369 introduced from Russia have stronger cold resistance than domestic cultivars Onobrychis viciaefolia. Scop. cv. Mengnong， Onobrychis viciaefolia. Scop.cv. Gansu.

Key words：Onobrychis viciifolia；Germplasm resources；Physiological and biochemical；Cold resistance

紅豆草（Onobrychis viciaefolia）具有固氮、耐旱、耐寒、耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)抗病和速生等特點(diǎn)，堪稱“牧草皇后”，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、粗脂肪和礦物質(zhì)，草質(zhì)柔軟，氣味芳香，葉量豐富，可用于青飼、青貯、放牧、曬制青干草、加工草粉、配合飼料和多種草產(chǎn)品[1 ]。紅豆草含有單寧，可沉淀在動(dòng)物瘤胃中形成大量泡沫性可溶性蛋白質(zhì)，故反芻家畜在青飼、放牧?xí)r不易發(fā)生膨脹病，是畜禽的上等飼料。紅豆草花冠粉紅色，顏色嬌美且花期長，是發(fā)展庭院經(jīng)濟(jì)和很好的蜜源植物，為干旱區(qū)、半干旱區(qū)、高寒區(qū)很有發(fā)展前途的豆科牧草。

低溫冷（凍）害是高寒牧區(qū)頻發(fā)的自然災(zāi)害之一，嚴(yán)重影響并制約著優(yōu)質(zhì)豆科牧草的生長發(fā)育。我國審定登記的紅豆草品種數(shù)量少（僅3個(gè)）且老化[2 - 3 ]。目前對其生產(chǎn)性能及營養(yǎng)價(jià)值、誘變選育、基因克隆、抗病性、光合特征等方面進(jìn)行了研究[4 - 10 ]，然而關(guān)于不同紅豆草種質(zhì)抗寒性的對比研究鮮見報(bào)道。

為豐富我國紅豆草種質(zhì)資源，為抗寒新品種選育提供原始材料，我們以農(nóng)業(yè)部從俄羅斯引進(jìn)及國內(nèi)審定登記的紅豆草為種質(zhì)材料，在田間自然降溫條件下，分析其對根系生理的影響，并用隸屬函數(shù)法對參試材料抗寒性進(jìn)行鑒定，以篩選應(yīng)對低溫脅迫的抗寒性材料及抗寒性鑒定指標(biāo)，為其進(jìn)一步開發(fā)利用及科學(xué)栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗(yàn)站進(jìn)行，試驗(yàn)地位于東經(jīng)105° 41'，北緯34° 05'，地處黃土高原西端，屬溫帶半干旱大陸性氣候。當(dāng)?shù)睾０?1 525 m，年均氣溫9.7 ℃，年均降水量200～320 mm，年均蒸發(fā)量1 664 mm，年均無霜期90～210 d。試驗(yàn)地土壤為黃綿土，黃土層較薄，0～20 cm土層土壤含有機(jī)質(zhì)8.44 g/kg、速效氮95.05 mg/kg、速效磷7.32 mg/kg、速效鉀82.45 mg/kg，pH為7.50。

1.2 試驗(yàn)材料及田間種植

供試紅豆草材料共7份，ZXY2010p-7369（I）、ZXY2003p-132（Ⅱ）、ZXY2007p-3423（Ⅲ）、ZXY

2005p-623（Ⅳ）、ZXY2003p-147（Ⅴ）均從俄羅斯引進(jìn)； 蒙農(nóng)紅豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv. Mengnong）（Ⅵ），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；甘肅紅豆草（Onobrychis viciaefolia Scop. cv. Gansu）（Ⅶ），由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理，每份材料為1處理，3次重復(fù)，小區(qū)面積10 m2（2 m×5 m），相鄰2個(gè)小區(qū)設(shè)0.5 m的保護(hù)行。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)排列，于2014年7月28日人工開溝條播，播深3 cm，行距30 cm，播量為60 kg/hm2。試驗(yàn)期間各小區(qū)均不施肥，不灌溉。

1.3 取樣與測定方法

分別于2015年11月1日、12月1日及2016年1月1日、2月1日、3月1日從各試驗(yàn)小區(qū)中隨機(jī)挖取供試材料的根系，取長10 cm的根及根頸用錫箔紙包裹，放入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室保存在-80 ℃冰箱備用。采用蒽酮比色法測定可溶性糖（WSS）含量，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定可溶性蛋白質(zhì)（SP）含量，酸性茚三酮法測定脯氨酸（Pro）含量，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性 [11 - 15 ]。各測定指標(biāo)均3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理和評價(jià)方法

用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析（Duncan新復(fù)極差法）和主成分分析。應(yīng)用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬度函數(shù)法進(jìn)行綜合評判[16 ]，對與抗寒性呈正相關(guān)參數(shù)的WSS、SP、Pro、CAT和POD采用公式Fij=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin），對與抗寒性呈負(fù)相關(guān)參數(shù)的MDA采用公式Fij=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）。式中，F(xiàn)ij為i品種的j性狀測定的具體隸屬值；Xij為i品種j性狀測定值；Xjmin為i品種j性狀中測定的最小值；Xjmax為i品種j性狀中測定的最大值；然后將每個(gè)供試材料所有性狀的具體隸屬值進(jìn)行累加，求平均值，得到其隸屬度。

2 結(jié)果與分析

2.1 越冬表現(xiàn)

越冬率能夠直觀的反映植株在同一田間條件下抗寒能力的強(qiáng)弱。由圖1可知，2015年11月至2016年3月的平均氣溫在0.5～2.1℃波動(dòng)，平均土溫在1.1～5.0 ℃波動(dòng)。其中2016年1月份的平均氣溫和土溫均最低，分別為-7.8 ℃和-6.9 ℃。經(jīng)觀測，在上述條件下，不同紅豆草材料田間越冬率均達(dá)100%，可見在蘭州地區(qū)各供試紅豆草材料均能安全越冬。

2.2 根系可溶性糖含量的變化

由表1可見，各供試紅豆草的可溶性糖含量隨著生育期推移先增后降。2015年11月至2016年1月，可溶性糖含量均顯著增加（P < 0.05），且在1月份達(dá)到最大值，材料Ⅱ、Ⅶ的可溶性糖含量顯著高于其余材料；2016年1—3月，可溶性糖含量均顯著降低（P < 0.05），且在2016年3月份其含量達(dá)到最小值，材料Ⅳ可溶性糖含量顯著低于材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ（P < 0.05）。

2.3 根系可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

由表2可見，各供試紅豆草的可溶性蛋白質(zhì)含量變化均表現(xiàn)為隨氣溫的降低而增加，隨氣溫的回升而下降。2015年11月至2016年1月，可溶性蛋白質(zhì)含量緩慢升高，材料Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ在2016年1月達(dá)最大值，分別是2015年11月份的9.87%、14.74%和7.69%；2016年1—2月，材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ的可溶性蛋白質(zhì)含量持續(xù)升高并在2月份達(dá)到最大值，分別是2015年11月的1.45、1.50、1.38、1.11倍，其余材料均緩慢下降；2016年2月后可溶性蛋白質(zhì)含量均降低，且材料Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ在2016年3月達(dá)到最小值。

2.4 根系脯氨酸含量的變化

由表3可見，各供試紅豆草的脯氨酸含量隨溫度季節(jié)變化均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。2015年11月至2016年1月，各材料的脯氨酸含量迅速積累升高，在2016年1月達(dá)到峰值，材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的脯氨酸含量分別是2015年11月份的11.77、1.24、2.43、1.39、2.08、4.30、1.44倍，且材料Ⅱ的脯氨酸含量顯著高于其余材料（P < 0.05）。2016年1月之后，脯氨酸含量快速下降，除材料Ⅳ、Ⅶ外，其余材料2016年3月份的脯氨酸含量均顯著高于2015年11月份的含量（P < 0.05），且材料Ⅱ明顯高于其余材料（P < 0.05）。

2.5 根系MDA含量的變化

由表4可見，各供試紅豆草的MDA含量隨著生育期的推移均呈下降趨勢。2015年11月初，各供試材料的MDA含量有明顯差異（P < 0.05）；2015年11月至2016年1月，隨著氣溫的降低各供試紅豆草的MDA含量均表現(xiàn)緩慢下降。2016年1月之后，MDA含量持續(xù)降低并于2016年3月份達(dá)到最小值，此時(shí)材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的MDA含量比2015年11月份分別下降了85.78%、69.98%、48.66%、26.70%、52.54%、34.64%和55.50%，且材料Ⅰ和Ⅱ的MDA含量顯著低于其余材料（P < 0.05）。

2.6 根系CAT活性的變化

各供試紅豆草根系CAT對低溫脅迫反應(yīng)敏感，其受低溫影響變化情況見表5，各材料的CAT活性隨氣溫的變化均呈現(xiàn)先增加后下降趨勢。11月到翌年1月，CAT活性快速增加，在1月均達(dá)到最大值，材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的CAT活性是11月份的2.28、3.56、2.08、1.99、1.38、1.15、2.35倍，且材料Ⅰ和Ⅲ的CAT活性顯著（P < 0.05）高于其余材料，說明CAT活性的增加能夠幫助植物更有效地清除自由基，材料Ⅰ和Ⅲ清除自由基的能力更強(qiáng)。1月到3月，隨著氣溫回升，CAT活性急劇下降，材料Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ CAT活性下降速度較快，較1月份分別下降了73.13%、67.22%和72.74%。

2.7 根系POD活性的變化

由表6可見，各供試紅豆草的POD活性與CAT活性變化趨勢基本一致。2015年11月至2016年年1月，各材料的POD活性急劇升高并在2016年1月份達(dá)到最高水平，此時(shí)材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的POD活性是2015年11月份的2.69、1.96、2.46、1.51、1.92、1.15、1.69倍，且材料Ⅱ的POD活性顯著高于其余材料（P < 0.05），表明紅豆草根系在遭受低溫脅迫后，POD活性增加以抵抗自由基的氧化傷害。2016年1 — 3月，各材料POD活性急劇下降，材料Ⅱ的POD活性顯著高于其余材料（P < 0.05）；除材料Ⅰ、Ⅳ之外，其余材料POD活性均在2016年3月份達(dá)到最低水平。

2.8 抗寒性綜合評價(jià)

采用隸屬函數(shù)法，將不同紅豆草種質(zhì)6項(xiàng)抗寒參數(shù)隸屬函數(shù)值加起來求其平均值得其綜合評價(jià)值，抗寒性強(qiáng)弱順序依次為ZXY2003p-132、ZXY2010p-7369、蒙農(nóng)紅豆草、甘肅紅豆草、ZXY2003p-147、ZXY2005p-623、ZXY2007p-3423（圖2）。

3 結(jié)論與討論

植物在逆境下的生長和發(fā)育都是受限的，它對外界刺激的反應(yīng)就是合成和積累大量的蛋白質(zhì)和與應(yīng)激耐受性相關(guān)的小分子物質(zhì)[17 ]。低溫脅迫下脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可降低細(xì)胞水勢，增強(qiáng)持水力，也可緩和細(xì)胞外結(jié)冰后細(xì)胞失水，增強(qiáng)膜的穩(wěn)定性，亦是植物越冬、再生的能量和物質(zhì)來源，與植物抗寒性密切相關(guān)[18 ]。本研究表明，盡管隨著氣溫的降低不同供試紅豆草材料的根系可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和脯氨酸含量都表現(xiàn)增加的趨勢，但脯氨酸含量增加的趨勢最明顯且呈線性增加，可溶性蛋白質(zhì)含量的增加幅度相對較??；可溶性糖含量在最冷月到來時(shí)也迅速增加，表明不同紅豆草材料在低溫到來時(shí)首先通過快速積累脯氨酸防止細(xì)胞失水，保護(hù)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，以減少冷害；后期脯氨酸含量和可溶性糖含量繼續(xù)增加，可降低紅豆草組織的冰點(diǎn)，減少結(jié)冰傷害。

低溫脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，引發(fā)膜脂過氧化，產(chǎn)生膜脂過氧化產(chǎn)物MDA，對細(xì)胞產(chǎn)生傷害作用[19 ]。同時(shí)植物體內(nèi)還存在著CAT、POD等抗氧化酶系統(tǒng)以清除活性氧、減輕逆境脅迫對植物細(xì)胞造成的傷害[20 - 21 ]。本研究表明，低溫脅迫下，紅豆草根系CAT活性、POD活性持續(xù)升高，MDA 含量持續(xù)降低，CAT活性和POD 活性的增加可以減輕低溫對生物膜的迫害，對細(xì)胞起到保護(hù)作用。

植物抗寒性是多基因控制的數(shù)量性狀，單一的生理指標(biāo)難以全面準(zhǔn)確反映抗寒性的強(qiáng)弱，可結(jié)合與抗寒性有關(guān)的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行抗寒性評 價(jià)[22 ]。隸屬函數(shù)分析提供了一條在多指標(biāo)測定基礎(chǔ)上對植物抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)的途徑。本研究運(yùn)用隸屬函數(shù)法對不同紅豆草根系可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、脯氨酸含量、MDA含量、CAT 活性及POD活性 6 個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明，7份供試紅豆草材料抗寒性由大到小依次為ZXY2003p-132、ZXY2010p-7369、蒙農(nóng)紅豆草、甘肅紅豆草、ZXY2003p-147、ZXY2005 p-623、ZXY2007p-3423，從俄羅斯引進(jìn)的紅豆草種質(zhì)材料ZXY2003p-132和ZXY2010p-7369較國內(nèi)2份材料蒙農(nóng)紅豆草、甘肅紅豆草抗寒性強(qiáng)，這為抗寒新品種選育提供了原始材料。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）