朱玉欣,馬維超,范永超,馮 波,張 倩,董 虹,穆 祥

[1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 昌平 102206;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ,北京 海淀 100193]

抗生素作為飼料添加劑具有促進(jìn)機(jī)體生長的作用,但長期、大量地使用抗生素會(huì)給動(dòng)物源性食品安全帶來諸多問題,因此世界各國開始限制或禁止抗生素在飼料中的使用,并開始研發(fā)新型促生長飼料添加劑來逐步替代抗生素。目前,關(guān)于飼料添加用抗生素促生長的機(jī)理尚不完全清楚。通過查閱文獻(xiàn)及本團(tuán)隊(duì)前期研究,我們認(rèn)為抗生素促生長的機(jī)制可能是抑制了飼料在儲(chǔ)藏過程中細(xì)菌的增殖,進(jìn)而減少細(xì)菌毒素的釋放。反之,飼喂含有大量細(xì)菌或毒素的飼料會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生長遲緩。因此,本研究嘗試通過灌服細(xì)菌懸液及細(xì)菌毒素的方式建立小鼠生長遲緩模型,期望能夠?yàn)檠邪l(fā)具有細(xì)菌毒素滅活作用的中藥飼料添加劑提供動(dòng)物模型。

1　材料

1.1試驗(yàn)菌株及試驗(yàn)材料 大腸桿菌K99來自北京農(nóng)學(xué)院,獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏;Yeast Extract、Tryptone,均購自 OXOID 公司,批號(hào)分別為LP0021、LP0042;NaCl,購自VETEC公司,批號(hào)V900058-500G;麥康凱培養(yǎng)基,購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào)02-005A;小鼠IL-6試劑盒及TNF-α試劑盒,均購自美國R&D公司;SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠,體重10-12 g,80只,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]。

1.2試驗(yàn)儀器 生物安全柜(Thermo公司);電子天平(上海天平儀器廠);渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);精密pH計(jì)(SANYO公司);顯微鏡(OLYMPUS公司);細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);多功能酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司);全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

2　方法

2.1大腸桿菌的培養(yǎng)及破碎 將凍存的大腸桿菌K99室溫融化后接種到5 mL LB培養(yǎng)基中,37℃,220 r/min,培養(yǎng)24 h。將100 μL此菌液接種到5 mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18 h,劃線接種到麥康凱平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h,挑取狀態(tài)良好的單菌落接種到LB培養(yǎng)基中,進(jìn)行增菌鏡檢。取純化后的菌液100 μL接種到5 mL LB培養(yǎng)基中,共接18管,37℃,220 r/min,分別在 16、18、20、22、24 h 取 3 管,測(cè)定生長曲線。根據(jù)生長曲線選擇細(xì)菌破碎時(shí)間。將大腸桿菌菌體懸液放入50 mL小燒杯中,超聲破碎儀進(jìn)行破碎,每間隔5 s破碎5 s;每5 min檢測(cè)一次菌體破碎液的OD600nm值(600 nm),破碎10 min后,取少量液體進(jìn)行革蘭染色鏡檢,觀察細(xì)菌狀態(tài)。

2.2動(dòng)物分組 將80只SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠分為4組,每組20只?？瞻捉M、上清組、破碎組、懸液組分別給予生理鹽水、細(xì)菌上清、破碎液及細(xì)菌懸液,0.2 mL/只,連續(xù)灌胃 15 d。

2.4炎性因子的測(cè)定 對(duì)稱量完體重的各組小鼠進(jìn)行眼球采血,室溫靜置1 h,3 000 r/min離心15 min后收集血清,使用ELISA試劑盒測(cè)定IL-6、TNF-α的水平。

2.5臟器指數(shù)的測(cè)定 脫頸處死采血后的各組小鼠,采集肺臟、肝臟、脾臟并稱重,計(jì)算臟器指數(shù)。計(jì)算公式為:臟器指數(shù)=臟器重量(ɡ)/活體重(ɡ)。

2.6統(tǒng)計(jì)分析 使用SPASS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P≤0.05為差異顯著,P≤0.01為差異極顯著。

3　結(jié)果

3.1大腸桿菌K99生長曲線 如圖1所示,在培養(yǎng)到16～20 h細(xì)菌達(dá)到平臺(tái)期,在22 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大,之后隨著時(shí)間的延長活菌數(shù)下降。

圖1　細(xì)菌生長曲線

3.2細(xì)菌破碎時(shí)間的篩選 在10 min之內(nèi),隨著破碎時(shí)間的延長,細(xì)菌懸液吸光度不斷下降,10 min后,吸光度不再改變(圖2)。取破碎10 min的菌液鏡檢,細(xì)菌失去正常的形態(tài),活性喪失(圖3)。

圖2　細(xì)菌破碎

圖3　破碎10 min后的細(xì)菌 (100×)

3.3小鼠生長性能 與空白組相比,細(xì)菌上清組、日增重顯著下降(P＜0.05),破碎組日增重極顯著下降(P＜0.01),如圖4所示。細(xì)菌上清組、破碎組及懸液組日采食量與空白組相比均有所下降,但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P＞0.05)(圖5)。

3.4臟器指數(shù)的測(cè)定 與空白組相比,細(xì)菌上清組、破碎組、懸液組肺臟指數(shù)極顯著升高(P＜0.01),脾臟指數(shù)極顯著下降 (P＜0.01),肝臟、胸腺指數(shù)無顯著變化(P＞0.05)(圖6)。

圖4　小鼠日增重

圖5　小鼠日采食量

圖6　臟器指數(shù)

3.5IL-6及TNF-α的水平 空白、上清、破碎、懸液4組中,大部分小鼠血清中 IL-6均在0～20 pg/mL之間,而破碎和懸液兩組中極少數(shù)的小鼠血清中IL-6含量在20 pg/mL以上,但均無顯著差異(P＞0.05)(圖7)。上清、破碎、懸液3組中小鼠血清中TNF-α較穩(wěn)定,與空白組比均無差異(P＞0.05),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。

圖7　小鼠血清IL-6水平

圖8　小鼠血清TNF-α水平

4　討論與結(jié)論

在感染過程中,為對(duì)抗機(jī)體的免疫系統(tǒng),細(xì)菌會(huì)在不同的時(shí)期表達(dá)不同的毒力因子,在這些毒力因子中發(fā)揮主要作用的就是細(xì)菌毒素[1],包括外毒素和內(nèi)毒素。外毒素是大部分病原菌在代謝過程中分泌到菌體外的蛋白質(zhì),細(xì)菌產(chǎn)生的外毒素對(duì)組織的毒性作用有高度的選擇性,各自引起特殊的臨床癥狀。內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分,其主要化學(xué)成分為脂多糖[2],不同病原菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素引起的癥狀大致相同,都能引起機(jī)體體溫升高、腹瀉和出現(xiàn)出血性休克和其他癥狀[3-5]。但利用毒素建立生長遲緩模型的研究鮮有報(bào)道,因此,本試驗(yàn)研究嘗試采用灌服細(xì)菌培養(yǎng)上清液及破碎液的方法來建立小鼠生長遲緩模型。

細(xì)菌外毒素在生長繁殖的過程中分泌到菌體外,但也有少數(shù)則存在菌體內(nèi),當(dāng)細(xì)菌裂解后釋放到菌體外。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌體后才釋放出來。因此,只有破碎細(xì)菌才能獲得高濃度的細(xì)菌毒素。通過對(duì)K99生長曲線的測(cè)定可知,16～20 h是該菌生長的平臺(tái)期,22 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大,此時(shí),細(xì)菌毒素產(chǎn)生的速率最大,24 h時(shí),活菌數(shù)顯著下降,其可說明在24 h時(shí)產(chǎn)生的毒素是最多的,因此選擇此時(shí)進(jìn)行細(xì)菌破碎可獲得最大的毒素濃度。張帥[6]報(bào)道采用微波法、珠磨法、超聲波法、反復(fù)凍融法、石英砂研磨法分別對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行細(xì)胞破碎分離細(xì)菌毒素,結(jié)果表明超聲波破碎法細(xì)胞破碎效果最好。本試驗(yàn)采取超聲破碎的方法進(jìn)行細(xì)菌破碎,隨著超聲時(shí)間的延長,探頭溫度上升,易破壞細(xì)菌外毒素,因此我們選擇工作5 s,間隔5 s,而且將菌液放入冰上以維持低溫。隨著破碎時(shí)間的延長,OD值成依賴性下降,破碎10 min時(shí),OD值達(dá)到最低,取菌液進(jìn)行革蘭染色,菌體失去原有的形態(tài),說明細(xì)菌已完全破碎。

盡管細(xì)菌的外毒素和內(nèi)毒素在結(jié)構(gòu)性質(zhì)和作用機(jī)制上完全不同,但都能不同程度地對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。體重是衡量小鼠生長發(fā)育的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示,細(xì)菌上清組日增重與空白組相比顯著下降;破碎組、懸液組日增重與空白組相比極顯著下降,其說明細(xì)菌毒素能夠使小鼠生長遲緩,模型建立成功。動(dòng)物的臟器指數(shù)是重要的生物學(xué)特性指標(biāo)之一,其數(shù)值大小可以在一定程度上反映機(jī)體的功能狀態(tài)。前期有報(bào)道[7]表明,口服嘔吐毒素組和各聯(lián)合毒素組小鼠增重顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);嘔吐毒素組、煙曲霉素B1組和各聯(lián)合毒素組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。細(xì)菌毒素可能會(huì)通過影響機(jī)體器官功能狀態(tài),進(jìn)而造成動(dòng)物的生長遲緩。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)菌上清組、破碎組、懸液組對(duì)脾臟指數(shù)的影響差異均顯著。

內(nèi)毒素可以激活在上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上的Toll樣受體4,然后通過骨髓分化初級(jí)反應(yīng)基因88(MyD88)依賴途徑激活NF-κB,釋放IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子[8]。IL-6可通過誘導(dǎo)纖維蛋白原啟動(dòng)凝血因子,在腸道黏膜異常堆積,使炎癥反應(yīng)不斷加重[9]。TNF-α可在受損的腸黏膜中大量表達(dá),并且其病變范圍越大、病變?cè)絿?yán)重,TNF-α水平越高[10]。我們猜測(cè),口服細(xì)菌毒素會(huì)導(dǎo)致腸黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng),進(jìn)而影響生長性能。因此,我們通過檢測(cè)IL-6、TNF-α的水平來驗(yàn)證口服細(xì)菌毒素是否會(huì)造成小鼠炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明,通過灌服細(xì)菌毒素的方式對(duì)大部分小鼠不會(huì)引起炎性反應(yīng)。此外,Dutch Committee on Occupational Standards證實(shí):口服LPS對(duì)健康的人群只會(huì)造成微弱的傷害[11]。因此,我們推測(cè)造成小鼠生長遲緩的原因并不是毒素進(jìn)入機(jī)體引起炎癥反應(yīng)造成的。本研究中極少數(shù)小鼠血清IL-6水平升高可能是個(gè)體腸道機(jī)能減退造成的。

近半個(gè)世紀(jì)以來,抗生素作為抗菌助長劑添加到飼料中,對(duì)控制畜禽疾病的發(fā)生,促進(jìn)畜禽生長發(fā)育,提高飼養(yǎng)效益確實(shí)起到積極的作用。目前,抗生素促生長的機(jī)理尚不明確。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為抗生素的各種作用效果都是基于抗生素對(duì)腸道微生物的直接作用。Niewold則認(rèn)為抗生素具有促生長的作用可能是其抑制動(dòng)物腸道的炎癥反應(yīng)[12]。我們認(rèn)為飼料在儲(chǔ)存過程中,易滋生細(xì)菌,產(chǎn)生大量的細(xì)菌毒素,其是引起動(dòng)物生長遲緩的主要原因,飼用抗生素主要通過抑制有害病原微生物的增殖及活性,進(jìn)而減少毒素的釋放量,起到促動(dòng)物生長的效果。本試驗(yàn)中細(xì)菌破碎液和細(xì)菌懸液均能極顯著降低小鼠體重,說明細(xì)菌可通過產(chǎn)生毒素抑制動(dòng)物生長。但是,長期、大量地使用抗生素可能會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性[13]等多種副作用。因此,世界各國陸續(xù)開始限制或禁止將抗生素添加在飼料里[14]。中藥具有天然性、毒副作用小、無殘留和無耐藥性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[15-16],可作為抗菌和促生長的飼料添加劑,具有廣闊的開發(fā)前景。目前,在代替抗生素的中藥飼料添加劑開發(fā)研究領(lǐng)域,尚缺乏統(tǒng)一的動(dòng)物模型。本研究中建立的小鼠生長遲緩模型,可為該領(lǐng)域提供穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,促進(jìn)中藥添加劑的研究發(fā)展,也可為相關(guān)模型建立與發(fā)展提供一定的參考。

本研究通過灌服細(xì)菌毒素成功建立了小鼠生長遲緩模型,為研究替代抗生素飼料添加劑提供了動(dòng)物模型,但是本研究還存在很多不足。本試驗(yàn)采用大腸桿菌K99上清及破碎均是小鼠日增重顯著下降,但是其產(chǎn)生的毒素種類復(fù)雜,尚不清楚是那一種毒素還是幾種毒素聯(lián)合導(dǎo)致小鼠生長遲緩,還需進(jìn)一步研究。灌服毒素抑制生長的機(jī)制還不清楚,其機(jī)理還需深入研究,通過本試驗(yàn)初步確定與炎性因子IL-6、TNF-α水平升高無關(guān)。

本研究表明,成功建立了灌服細(xì)菌毒素導(dǎo)致小鼠生長遲緩的模型,可為開發(fā)具有滅活細(xì)菌毒素的中藥添加劑提供動(dòng)物模型。

參考文獻(xiàn):