陽 月,劉天龍,張瑩瑩,孫振寧,王自力

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院 ,重慶 北碚 400700;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

納米金團(tuán)簇是指在一定的分子層保護(hù)下,由幾個到幾百個金原子組成的相對穩(wěn)定的聚集體。由于其具有尺寸小、光穩(wěn)定好、制備條件溫和等突出的優(yōu)點,納米金團(tuán)簇在熒光成像、生物檢測、食品安全檢測等領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景[1-4]。隨著應(yīng)用的增多,納米金團(tuán)簇潛在的生物毒性問題也逐漸引起人們的重視,但相關(guān)毒性研究仍非常少。本文首次評價了納米金團(tuán)簇經(jīng)滴鼻暴露對小鼠的急性毒性作用,為納米金團(tuán)簇的生物應(yīng)用提供毒理學(xué)實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物 雌性ICR小鼠60只,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,6～8周齡,體重20～22 g,隨機(jī)分為4組,每組15只。

1.2納米金團(tuán)簇的制備及表征 根據(jù)Liu.X等[5]的方法來制備熒光納米金團(tuán)簇。稱取2 g BSA攪拌溶解于40 mL去離子水中,滴加40 mL 10 mmol/L氯金酸,隨后置于37℃孵育30 min,后用1 mol/L NaOH溶液將混合溶液的pH值調(diào)至12,置于37℃過夜。然后在去離子水中透析48 h除去未反應(yīng)完全的金離子。制備好的納米金團(tuán)簇于Hitachi S-4300電子顯微鏡下進(jìn)行拍照,并對其熒光吸收強(qiáng)度進(jìn)行測量。

鉤藤灰霉病可用0.5%小檗堿水劑200～500倍，或3億CFU/克哈茨木霉菌20～50倍，或10億個/克枯草芽孢桿菌800～1 000倍，或40%嘧霉胺懸浮劑1 000～1 500倍，或50%異菌脲懸浮劑1 000～1 500倍噴霧或煙霧。

1.3動物模型與樣品采集 將納米金團(tuán)簇溶液用PBS 稀釋配制 1、0.2、0.1 mg/mL 溶液,小鼠肌肉注射0.1 mL 1%戊巴比妥鈉溶液麻醉,滴鼻50 μL的不同濃度的納米金團(tuán)簇溶液。滴鼻后的1 d、5 d,14 d各組隨機(jī)選取5只小鼠,眼內(nèi)眥靜脈采血進(jìn)行血常規(guī)檢測,另摘除眼球取血,分離血清進(jìn)行血生化指標(biāo)檢測。取小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦組織,4%中性甲醛溶液固定,取部分組織制作冰凍切片進(jìn)行熒光信號觀察。

1.4血液學(xué)分析 采取抗凝血進(jìn)行血常規(guī)檢測,指標(biāo)為紅細(xì)胞比容(HCT)、血紅蛋白數(shù)(HGB)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、血小板數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、白細(xì)胞數(shù)(WBC)。采集血清進(jìn)行血生化指標(biāo)檢測,指標(biāo)為ALT,AST,BUN和CREA。

1.5組織切片 經(jīng)甲醛固定液充分固定的小鼠組織,依常規(guī)程序制作石蠟切片,H.E.染色,顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6體內(nèi)分布 各組織冰凍切片置熒光顯微鏡下觀察,激發(fā)波長為,納米金團(tuán)簇為紅色熒光,檢測各組織中熒光信號強(qiáng)度和分布。

1.7數(shù)據(jù)處理 所用數(shù)據(jù)均用SPSS 16軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,以P＜0.05表示顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1納米金團(tuán)簇的表征 納米金團(tuán)簇溶液澄清,淺黃色,分散良好,在紫外光下呈紅色熒光,見中插彩版圖1A,發(fā)射波長為650 nm。在電鏡下,納米金團(tuán)簇大小為1～3 nm,顆粒均勻,單分散,如中插彩版圖1B所示。

2.2小鼠存活率及體重變化 小鼠滴鼻暴露后無明顯臨床變化,實驗結(jié)束前未出現(xiàn)死亡動物,與對照組相比,各染毒組小鼠的體重?zé)o明顯變化,1 mg/kg·bw組小鼠體增重低于對照組,但差異不顯著。

表1　各實驗組不同時間點血常規(guī)白細(xì)胞數(shù)量結(jié)果

2.3血液學(xué)結(jié)果 除白細(xì)胞數(shù)外,染毒組小鼠其他血常規(guī)指標(biāo)均與對照組無明顯差異。如表1所示,1 mg/kg·bw劑量染毒組的白細(xì)胞數(shù)1 d時明顯高出對照組,但在5 d時有下降趨勢,隨后又在14 d時達(dá)到最高,差異極顯著。其他兩個劑量組與對照組相比各指標(biāo)無明顯差別。

表2　各實驗組不同時間點ALT含量結(jié)果

如表2和表3所示,1 mg/kg·bw劑量染毒組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)指標(biāo)明顯高于對照組,且隨著時間的延長而升高。各劑量染毒組血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)與對照組相比無明顯差異。

表3　各實驗組不同時間點AST含量結(jié)果

2.4組織化學(xué)結(jié)果 分別對心、肝、脾、肺、腎、腦組織進(jìn)行了H.E.染色,鏡下觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),染毒組小鼠的腦、腎、心、脾組織均無明顯病變出現(xiàn)。1 mg/kg·bw劑量染毒組小鼠肺臟可見出血,肺泡隔增寬,肺泡內(nèi)有少量炎性細(xì)胞,如中插彩版圖2B黑色箭頭所示,染毒組在小鼠的肝組織中有散在炎性灶,如中插彩版圖2D黑色箭頭所示,肝細(xì)胞腫脹變性。中插彩版圖2A為對照組肺臟,中插彩版圖2C為對照組肝臟。

2.5金團(tuán)簇體內(nèi)分布結(jié)果 熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明,在肝臟和肺臟中可見紅色熒光顆粒,其他臟器未觀察到紅色熒光顆粒存在,說明金團(tuán)簇經(jīng)滴鼻暴露后主要分布于肺臟與肝臟,這與血生化指標(biāo)結(jié)果和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果一致。

3　討論

隨著納米技術(shù)的迅猛發(fā)展,納米級產(chǎn)品的應(yīng)用越來越多,但納米材料的生物安全性問題一直未得到解決。納米金團(tuán)簇作為一種新型的熒光納米材料近年來在生物檢測、食品安全檢測方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景,但隨著其應(yīng)用的增多,人們接觸該納米級材料的可能性也增大,其潛在的生物毒性成為制約其進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸問題。本試驗通過滴鼻的方式給小鼠暴露納米金團(tuán)簇,通過血液學(xué)檢測,組織形態(tài)學(xué)觀察來評價納米金團(tuán)簇對小鼠的毒性作用。血常規(guī)數(shù)據(jù)表明了染毒組的WBC明顯高于對照組,說明納米金團(tuán)簇可以引起小鼠體內(nèi)的急性炎癥反應(yīng);血生化指標(biāo)數(shù)據(jù)表明,染毒組的ALT和AST明顯高于對照組,而BUN和CREA無明顯差異,說明了納米金團(tuán)簇對小鼠的肝功能造成一定損傷,而對腎功能無明顯影響。組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),小鼠的肝、肺組織均出現(xiàn)炎癥,而其他組織未觀察到明顯病變。這些結(jié)果說明了納米金團(tuán)簇以滴鼻的途徑暴露后主要靶向器官為肝臟和肺臟。體內(nèi)分布結(jié)果顯示,在肺臟和肝臟發(fā)現(xiàn)紅色熒光信號,說明經(jīng)滴鼻吸入的納米金團(tuán)簇主要分布于肺臟和肝臟,這與組織形態(tài)學(xué)觀察得到的結(jié)果相一致,提示納米金團(tuán)簇可能通過肺臟進(jìn)入血液循環(huán)中,隨后被肝臟中的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)所捕獲。本文研究為納米金團(tuán)簇在生物學(xué)方面的應(yīng)用提供了必要的毒理學(xué)數(shù)據(jù)支持。