楊 幸,陳婷婷,肖希龍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

奶牛乳房炎是一種常見的疾病,對全球乳制品行業(yè)具有重要意義,它關(guān)系到巨大的經(jīng)濟(jì)損失和患病奶牛的福利問題,主要是由病原微生物感染所致,最常見的病原菌為大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和綠膿桿菌等。目前,奶牛乳房炎的臨床治療仍以抗生素為主,常用藥物以β-內(nèi)酰胺類為主,如阿莫西林、氨芐西林等。但是,隨著抗生素的濫用、臨床菌株的變異以及病原菌的多樣性,越來越多的病原體出現(xiàn)對抗生素的多重耐藥,因此,聯(lián)合用藥成為更好的選擇。阿莫西林(Amoxicillin)是β內(nèi)酰胺類抗生素,具有高效、廣譜、低毒的特點(diǎn),廣泛用于獸醫(yī)臨床,對革蘭陰性菌和陽性菌均有較強(qiáng)而迅速的殺菌作用,對溶血性鏈球菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌、白喉?xiàng)U菌、淋球菌、流感桿菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌等均有較強(qiáng)的抗菌作用[1]。硫酸黏菌素(Colistin Sulfate)是多肽類抗生素,主要對綠膿桿菌、大腸桿菌等大部分革蘭陰性桿菌有抗菌作用,局部用藥可用于敏感菌引起的牛乳腺炎、子宮炎等[2]。近年來,阿莫西林和硫酸黏菌素聯(lián)合用藥已有報(bào)道,且本實(shí)驗(yàn)室前期已成功研制出用于治療豬呼吸道疾病的阿莫西林/硫酸黏菌素復(fù)方制劑。本試驗(yàn)旨在通過考察阿莫西林與硫酸黏菌素對奶牛乳房炎病原菌的體外抗菌活性,以期為該制劑合理應(yīng)用于治療奶牛乳房炎提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料

1.1供試藥品 阿莫西林:含量86.9%,中國藥品生物制品檢定所(批號:130409-201512);硫酸黏菌素:含量98%,北京偶合科技有限公司(批號:1264-72-8)。

1.2供試菌株 大腸桿菌55株(山東濟(jì)南)、金黃色葡萄球菌71株(內(nèi)蒙古)、鏈球菌13株(山東濟(jì)南)(系臨床分離致病菌);質(zhì)控菌 ATCC25922、ATCC29213,均為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理與毒理教研室提供。

1.3培養(yǎng)基 MH肉湯、MH瓊脂、KF瓊脂、麥康凱瓊脂、科馬嘉瓊脂、小牛血清(供鏈球菌培養(yǎng)用)。

2　方法

2.1藥物儲備液的制備及保存 AMO儲備液 用pH值6.0,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并定容,配制終濃度為1 280 μg/mL,分裝至2 mL滅菌EP管中,密封于-20℃冰箱保存,有效期為1個(gè)月;COS儲備液用超純水溶解并定容,配制終濃度為2 560 μg/mL,分裝至2 mL滅菌EP管中,密封于-20℃冰箱保存,有效期為3個(gè)月。

2.2菌液的制備 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌保種菌液經(jīng)復(fù)蘇后分別涂布至麥康凱培養(yǎng)基、科馬嘉培養(yǎng)基及KF培養(yǎng)基,經(jīng)鑒別后確認(rèn)。各自挑取同一平板上性狀相似的1～2個(gè)菌落,肉湯增菌培養(yǎng)后涂布至MH培養(yǎng)基,接著挑取MH培養(yǎng)基中單個(gè)菌落,接種至1 mL MH肉湯(鏈球菌培養(yǎng)需加入5%小牛血清)中,于37℃下,大腸桿菌靜置培養(yǎng)6～8 h,金黃色葡萄球菌振蕩培養(yǎng)6～8 h,鏈球菌振蕩培養(yǎng)10～12 h,稀釋至試驗(yàn)所要求的1×106CFU/mL。

2.3藥物儲備液的稀釋 參照CLSI提供的藥物敏感性范圍及已發(fā)表文獻(xiàn)報(bào)道的阿莫西林和硫酸黏菌素對上述3種細(xì)菌的MIC值,確定藥物的稀釋終濃度。稀釋液為MH肉湯。

2.4單藥最低抑菌濃度(MIC)測定 參照CLSI抗生素藥敏試驗(yàn)中的微量稀釋法,采用96孔(12×8)U型稀釋板對藥物進(jìn)行無菌操作,1～10孔從高濃度至低濃度倍比稀釋,A-H共8排分4組,每組測1株菌,第11孔為有菌無藥陽性對照,第12孔為無菌無藥陰性對照。密封后將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)16～20 h、鏈球菌培養(yǎng)20～24 h后觀察記錄結(jié)果,試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 采用棋盤稀釋法8×8,以各菌株單藥MIC值確定稀釋濃度,最高濃度為MIC值的2倍,設(shè)6個(gè)稀釋濃度,依次倍比稀釋為1、1/2、1/4、1/8、1/16濃度,兩種藥物在96孔 U型稀釋板上按照橫向和縱向進(jìn)行聯(lián)合,G1和H1孔作為無菌無藥陰性對照,G2和H2孔作為有菌無藥陽性對照。接種菌量為1×106CFU/mL,密封后將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)16～20 h、鏈球菌培養(yǎng)20～24 h后觀察并記錄結(jié)果。

2.6結(jié)果判定

2.6.1MIC結(jié)果判定 在有黑色背景的光源下觀察,有菌生長的底部有沉淀,當(dāng)質(zhì)控菌MIC在范圍內(nèi),陽性對照孔內(nèi)細(xì)菌明顯生長,陰性對照孔內(nèi)未見細(xì)菌生長時(shí),無菌生長孔所含最低藥物濃度即為該菌株MIC。如出現(xiàn)多處跳孔,則結(jié)果無效,需重復(fù)試驗(yàn)。

2.6.2FIC 結(jié)果判定

協(xié)同作用:FIC≤0.5;相加作用:0.5 ＜FIC≤1;無關(guān)作用:1＜FIC≤2;拮抗作用:FIC＞2。

3　結(jié)果與分析

3.1阿莫西林和硫酸黏菌素單用的MIC結(jié)果 兩藥臨床分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌(共139株)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1,表中結(jié)果顯示,阿莫西林對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌的 MIC 范圍分別為 2.0 ～ 128.0 μg/mL、0.125 ～128.0 μg/mL 和0.125 ～1.0 μg/mL;硫酸黏菌素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌的MIC范圍分別為 0.5 ～ 8.0 μg/mL、32.0 ～ 128.0 μg/mL 和64.0 ～1 024.0 μg/mL。 阿莫西林對無乳及停乳鏈球菌高度敏感;對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌適度敏感;硫酸黏菌素對引起奶牛乳房炎的大腸桿菌表現(xiàn)出較高的敏感性,對金黃色葡萄球菌、鏈球菌的敏感性較低。

表1　阿莫西林和硫酸黏菌素對3種細(xì)菌的MIC及對應(yīng)菌株數(shù)

3.2阿莫西林和硫酸黏菌素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇部分已完成藥敏試驗(yàn)的臨床菌株(共20株)進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn),結(jié)果見表2和表3。結(jié)果表明,阿莫西林和硫酸黏菌素聯(lián)用后,對20株奶牛乳房炎大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌均無拮抗作用,呈協(xié)同與相加作用比例為60%,呈無關(guān)作用比例為40%。二者聯(lián)用對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌FIC平均值分別為0.91、0.85、1.25,對所有菌株的FIC平均值為0.93。這表明,阿莫西林和硫酸黏菌素聯(lián)用后對3種受試菌主要呈現(xiàn)相加作用。

4　討論

獸醫(yī)臨床中,阿莫西林為繁殖期殺菌劑(Ⅰ類),可破壞細(xì)胞壁的完整性,是治療鏈球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌的常用藥物,硫酸黏菌素為靜止期殺菌劑(Ⅱ類),主要影響細(xì)胞膜的通透性,常用于治療大腸桿菌、綠膿桿菌等革蘭陰性菌感染。阿莫西林硫酸黏菌素聯(lián)用,不僅擴(kuò)大抗菌譜,有利于治療臨床上的多種病原體感染,且通過不同抗菌機(jī)制,發(fā)揮二者的協(xié)同抗菌作用。

表2　阿莫西林和硫酸黏菌素對3種細(xì)菌的MIC和FIC

表3　阿莫西林和硫酸黏菌素聯(lián)合效果

國內(nèi)外已有報(bào)道,關(guān)于阿莫西林或硫酸黏菌素與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用。阿莫西林與阿米卡星[3]具協(xié)同作用、與硫酸黏菌素[4-6]以協(xié)同和相加作用為主、克拉維酸鉀[7]、與舒巴坦鈉[8]有協(xié)同作用,聯(lián)用均具有較強(qiáng)的抗菌活性;硫酸黏菌素與恩諾沙星[9]、硫酸黃連素[10]等多種藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用。牟曉燕[11]等用阿莫西林鈉與地塞米松治療奶牛急性乳房炎效果顯著。

本實(shí)驗(yàn)室李蘭等[5]前期研究了阿莫西林與硫酸黏菌素對57株供試菌聯(lián)合抗菌活性,結(jié)果顯示,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌和巴氏桿菌的體外抗菌作用以協(xié)同和相加作用為主,占比92.98%;呈無關(guān)作用比例為7.02%,無拮抗作用。在本試驗(yàn)中,阿莫西林和硫酸黏菌素聯(lián)用后,對奶牛乳房炎臨床菌株的協(xié)同和或相加作用比例略有下降,可能是由于臨床菌株樣本數(shù)較少、不同動(dòng)物源的菌株差異以及近年來細(xì)菌耐藥性嚴(yán)重造成的,這將有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,阿莫西林和硫酸黏菌素聯(lián)用后,對奶牛乳房炎臨床菌株主要呈相加或協(xié)同作用,具有擴(kuò)大抗菌譜、減少藥物劑量、降低細(xì)菌耐藥率的發(fā)生等優(yōu)勢,能有效防治多種病原菌引起的奶牛乳房炎,可為獸醫(yī)臨床上有關(guān)奶牛乳房炎制劑的研制及治療提供合理的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn):