侯耀杰,姜曉文,李子佳,于文會

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院,黑龍江 哈爾濱 150030)

腸炎是動物常見的臨床疾病,而胃腸黏膜損傷是腸炎主要病理變化。當腸黏膜損傷時,會影響動物的生產性能和對食物的吸收利用。現代獸醫(yī)學理論認為,牛源性大腸桿菌腹瀉,通常是由于體內大腸桿菌濃度增高,打破了腸道內微生物菌群的數量平衡,大腸桿菌吸附在小腸黏膜上皮細胞,進行繁殖并產生腸毒素。腸毒素通過刺激腸黏膜上皮細胞分泌大量液體,使細胞內離子濃度失衡,滲透壓改變,從而造成腹瀉,損害腸黏膜屏障,從而引起特征性的犢牛腹瀉臨床癥狀。肝臟與血液循環(huán)系統(tǒng)密切相連,當機體遭遇大腸桿菌感染時,攜帶大量病原菌的血液由腸道循環(huán)至肝臟,肝臟的吞噬功能受到抑制,內毒素滅活減少,致使內毒素進入體循環(huán),激活細胞因子,損傷腸道黏膜,造成肝臟的病變及損傷。具有粘附素的牛源性大腸桿菌表面的菌毛抗原與腸道上皮細胞黏膜上相對應的受體以高特異性的“鎖-匙”或誘導契合的方式結合,此時入侵機體的大腸桿菌才能在小腸上皮細胞定植及繁殖大量菌體進而發(fā)揮致病作用,而非菌毛因為結合狀態(tài)松散,受腸蠕動或腸道分泌液的作用下被排除在外[1]。

高娃[2]通過腹腔注射牛源性大腸桿菌,致使小鼠產生腹瀉,建立了腸道黏膜損傷模型。呂陽等[3]通過對腹瀉仔豬的研究,發(fā)現腹瀉影響仔豬腸黏膜結構及抗氧化功能。TNF-α對于腹瀉造成的腸道黏膜損傷,有顯著的介導作用[4-5]。TGF-β通過調節(jié)腸黏膜上皮的更新及損傷修復,維護腸黏膜的完整性[6]。我國傳統(tǒng)中藥在防治細菌性疾病方面積累了許多寶貴經驗,君臣佐使配合,互相協(xié)調作用,即可達到補氣升陽、扶正祛邪、標本兼治的治療效果。據報道,烏梅、黃連、木香等多味中藥抗菌活性較強,可以作為治療大腸桿菌病的首選藥[7]。王曉暉等[8]進行體外抑菌試驗,發(fā)現黃連、訶子等單味中藥均能使金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等臨床常見菌的繁殖受到抑制。本試驗通過對腹瀉小鼠的治療作用及氧化指標、腸道黏膜組織進行病理學觀察,分析中藥復方制劑的藥理作用,為臨床上治療腹瀉提供參考。

1　材料

1.1試驗動物 C57BL小鼠(體重16 g±2 g,雌雄各半),購自哈爾濱醫(yī)科大學。

1.2藥品 烏梅、黃連、白術、訶子等,均購自黑龍江省中草藥材大市場。

1.3主要試劑 犢牛腹瀉大腸桿菌(從犢牛腹瀉糞便中分離的DN0602(STa+,STx2+,EAST1+)),由東北農業(yè)大學傳染病實驗室惠贈。TAOC、SOD、MDA試劑盒,均購自南京建成生物試劑有限公司;TGF-α抗體、TGF-β抗體、二抗,購自武漢博士德生物公司。

1.4主要儀器 普通光學顯微鏡(上海幸行實業(yè)有限公司顯微鏡制造廠);紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

2　方法

2.1小鼠腹瀉模型的制備 把C57BL小鼠隨機分成5組,每組10只,雌雄各半,分別是空白對照組、模型組、高劑量組(20 g/kg體重)、中劑量組(10 g/kg體重)、低劑量組(5 g/kg體重)。適應性飼養(yǎng)3 d?？崭?2 h后,腹腔注射牛源性大腸桿菌菌懸液9.70 ×109CFU/mL,0.2 mL/10 g方法進行造模[9]。

2.2給藥方法 在細菌感染后4 h后,空白對照組和腹瀉模型組灌服0.2 mL/10 g體重生理鹽水,其他三組灌服對應藥液0.2 mL/10 g體重,1次/d,連續(xù)給藥5天進行臨床觀察。選擇造模后第1、3、5天的3個時間點進行剖檢。取肝臟組織及腸道組織待用。

2.4腸道黏膜TNF-α、TGF-β的檢測 石蠟切片用二甲苯脫脂、梯度酒精水化;切片放入3%H2O2浸泡10 min進行阻斷;蒸餾水脫洗次2 min/3次;高壓熱修復,冷卻40 min;蒸餾水、PBS清洗;擦片加入一抗,4℃保濕過夜;PBS沖洗一抗,5 min/3次。擦片加二抗,靜置20 min;PBS沖洗二抗,5 min/3次;DAB染色;自來水沖洗,蘇木素復染20 s,自來水沖洗;梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片鏡檢。結果判定:陽性細胞呈棕黃色,陰性細胞不著色。

2.5數據處理 采用SPSS17.0軟件對試驗數據進行單因素方差統(tǒng)計分析(One-Way ANOVA),結果以平均數±標準差(±s)表示,采用GraphPad Prism軟件作圖。P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

3　結果

3.1給藥后臨床觀察結果 各組在腹腔注射牛源性大腸桿菌后均出現不同程度的典型臨床腹瀉癥狀,主要表現為腹瀉、反應遲緩、精神委靡、腹式呼吸急促。連續(xù)給藥5 d后,高、中劑量組小鼠腹瀉癥狀消失,反應敏捷,飲食欲恢復正常。

3.2肝臟指標檢測結果

3.2.1小鼠肝臟SOD含量測定結果 由圖1可知,小鼠感染大腸桿菌后,各組SOD含量均出現不同程度的下降。第3天,與模型組相比,高劑量組差異顯著(P＜0.05);第5天,高劑量組SOD水平趨于正常,與模型組比較差異極顯著(P＜0.01)。

圖1　小鼠肝臟SOD含量測定結果

3.2.2小鼠肝臟T-AOC含量測定結果 由圖2可知,第1天,與模型組相比,各劑量組T-AOC水平表達明顯,第3天,與模型組相比,高、中劑量組TAOC的表達極顯著(P＜0.01);第5天,與模型組相比,口服液高、中劑量組差異極顯著(P＜0.01),低劑量組差異顯著(P＜0.05)。

圖2　小鼠肝臟T-AOC含量測定結果

3.2.3小鼠肝臟MDA含量測定結果 由圖3可知,與模型組相比,在第1天,高劑量組差異顯著(P＜0.05),中、低劑量組差異不顯著(P＞0.05);第3天,高劑量組下降水平顯著高于模型組(P＜0.05),其余各組差異不顯著(P＞0.05);第5天,各組MDA含量與模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。

圖3　小鼠肝臟MDA含量測定結果

3.3中藥復方制劑對腸道黏膜TNF-α表達檢測結果 TNF-α的陽性表達細胞為小腸上皮細胞,多在細胞胞漿內表達,陽性表達呈深棕黃色。正常組腸上皮細胞中也存在TNF-α呈弱陽性表達?？瞻捉M小腸上皮細胞中的TNF-α呈弱陽性表達。圖4中,給藥后第1天,各感染組TNF-α的表達量呈上升趨勢,其中以中、低劑量組、模型組與空白組相比差異顯著(P＜0.05),第3天后開始逐漸下降,至第5天,各組TNF-α的表達量與空白組相比無明顯差異(P＞0.05)(見圖5)。

3.4中藥復方制劑對腸道TGF-β表達檢測結果TGF-β的陽性表達細胞為小腸淋巴細胞,即部分細胞胞漿內表達,陽性表達呈深棕黃色。圖6中,給藥后第1天,模型組、各劑量組TGF-β表達量與空白組相比,均出現顯著升高(P＜0.05),第3天后開始逐漸下降,第5天,幾乎恢復到正常水平,各給藥組恢復的均比模型組快(見中插彩版圖7)。

圖4　口服液對腹瀉小鼠TNF-α表達的影響

圖6　口服液對腹瀉小鼠TGF-β表達的影響

4　討論

大腸桿菌引起的腹瀉按中獸醫(yī)理論進行辯證屬于大腸濕熱型腹瀉,大腸濕熱治療應以清熱燥濕、健脾補氣、收澀止瀉為組方原則,因此,本中藥復方由黃連、烏梅、訶子、白術等組成的。方中黃連具有止瀉、保護胃黏膜抗氧化、清除氧自由基等功效。烏梅通過抑制小腸運動從而起到抗腹瀉作用。訶子主要成分鞣質類對腸道起到澀腸止瀉作用。白術在治療腸胃運動、抗菌抗炎起到重要作用。通過臨床觀察發(fā)現,中藥復方制劑對大腸桿菌所致腸黏膜損傷起到修復作用。現代研究表明,腹瀉伴隨著氧化應激,導致機體的過氧化損傷。烏梅可通過加強過氧亞硝酸的清除及減少脂質過氧化的發(fā)生,治療機體的過氧化損傷[10]。試驗結果表明,中藥復方制劑可以極顯著的促進肝臟中SOD、T-AOC的表達,抑制MDA產生,改善肝臟氧化應激及病理狀態(tài)。減少脂質過氧化發(fā)生、穩(wěn)定細胞膜結構密切相關。這與齊海艷等[11]通過試驗發(fā)現了烏梅能提高總抗氧化能力,改善肝臟氧化應激及病理狀態(tài)。Hazra B等[12]報道,訶子所含的多酚類化合物和黃酮類化合物對抗氧化起重要作用等結果相一致。說明中藥復方制劑可以通過調節(jié)SOD、T-AOC的含量來修復腸黏膜損傷。

腸黏膜損傷的修復是一個復雜的過程,伴隨著各種細胞因子含量的變化。TNF-α對于腹瀉造成的腸道黏膜損傷,有顯著的介導作用[13]。TGF-β通過調節(jié)腸黏膜上皮的更新及損傷修復,維護腸黏膜的完整性。腸道黏膜損傷時,TGF-β促進絨毛腺窩區(qū)域細胞的分化、增殖、遷移,使修復細胞快速覆蓋損傷區(qū)域,從而保證腸黏膜的再生[14];同時,TGF-β本身是一種抗炎性細胞因子,腹瀉導致免疫系統(tǒng)紊亂,TGF-β通過刺激間質細胞的增生發(fā)揮重要的免疫調節(jié)作用[15]。本試驗研究結果表明,高劑量組較模型組相比,TNF-α的表達均明顯減少。中藥復方制劑各劑量組較模型組TGF-β的表達均明顯升高,其中高劑量最為顯著。田芳[16]通過試驗發(fā)現了黃連解毒湯調節(jié)TNF-α來治療類風濕性關節(jié)炎,增強自身免疫和抑制炎癥發(fā)生等結果相一致。說明中藥復方制劑可以通過下調TNF-α的含量,促進TGF-β的表達來抑制炎癥因子的產生,從而起到損傷修復作用

參考文獻: