趙 祥,于 潔,胡 靜,許靜秀,韓彩霞,李曉云,宋銘忻

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730046)

旋毛蟲(Trichinella spiralis)是一種全球性分布的人獸共患線蟲病,嚴(yán)重感染時(shí)可致人死亡。宿主因食用了生的或未煮熟的含有包囊型肌幼蟲的肉后而感染。旋毛蟲感染過程中必須經(jīng)歷胃部的極酸環(huán)境(pH值2～3),其對(duì)酸性環(huán)境的耐受機(jī)制現(xiàn)未清楚[1]。目前研究較為深入的抗酸機(jī)制是大腸桿菌,大腸桿菌主要有4種抗酸系統(tǒng):葡萄糖抑制抗酸系統(tǒng)、谷氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)、精氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)、谷氨酰胺依賴型抗酸系統(tǒng),當(dāng)大腸桿菌處于酸性環(huán)境時(shí),會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)多種抗酸系統(tǒng)的協(xié)同作用,從而在酸性環(huán)境中存活[2]。旋毛蟲肌幼蟲與大腸桿菌同樣作為食源性病原體,有關(guān)大腸桿菌的抗酸研究啟發(fā)我們旋毛蟲體內(nèi)或許存在類似抗酸系統(tǒng)來抵抗胃液的酸性環(huán)境,從而感染宿主致病。

谷氨酰胺作為一種非必需氨基酸在食物中廣泛存在且含量豐富,谷氨酰胺酶對(duì)谷氨酰胺的催化水解是谷氨酰胺依賴型抗酸系統(tǒng)中重要步驟[3]。本實(shí)驗(yàn)通過在酸性環(huán)境下培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光技術(shù)對(duì)旋毛蟲谷氨酰胺酶(T.spiralisglutaminase,TsGLS)表達(dá)量進(jìn)行分析,為進(jìn)一步闡明旋毛蟲抗酸機(jī)制提供線索。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 旋毛蟲分離自黑龍江豬旋毛蟲蟲株(編號(hào):ISS533),由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)昆明系小鼠傳代保存。TsGLS多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗家兔IgG(二抗),購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;rTaqDNA聚合酶、pMD18-T載體試劑盒、TRIZol和 SYBR?PremixEx TaqTMII,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;PCR儀為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;島津UV-120-02型紫外分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品;ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank上發(fā)表的旋毛蟲TsGLS mRNA參考序列(ACCESSION:XM_003375164)和 TsGAPDH mRNA參考序列(登錄號(hào):AF452239.1),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。TsGLS基因熒光定量上游引物:5′-ATCCGAACAAGGGCAACTG-3′,下游引物:5′-CGGCACTGATACCAAACCAT-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149bp;TsGAPDH基因熒光定量上游引物:5′-TGGCTTAGCTCCGTTGG-3′,下游引物:5′-TTTGGGTTGCCGTTGTA-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段為 92 bp。上述引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3旋毛蟲肌幼蟲的收集與培養(yǎng) 取感染旋毛蟲肌幼蟲40 d的昆明系小鼠5只處死,剔出肌肉,經(jīng)組織搗碎機(jī)打碎,收集肉液中游離出的旋毛蟲肌幼蟲。將收集到的蟲體用DEPC水洗滌3次,以1 000條肌幼蟲/1 mL/孔,分別放入 pH 值為 2.5、4.0、6.6和9.0、含生理鹽水的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 0.5 h、1 h、3 h 后,收集蟲體,放入4℃冰箱備用[4-5]。

1.4旋毛蟲總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 將上述蟲體于加液氮的滅菌研缽中研磨,按照TRIZol Reagent RNA試劑盒操作說明書,提取旋毛蟲總RNA,測(cè)定OD值及 RNA 濃度(D260nm/D280nm在 1.8～2.1之間)。利用旋毛蟲總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用旋毛蟲cDNA為模板擴(kuò)增TsGLS和TsGAPDH基因:95℃10 min;95℃ 30 s;60℃30 s和72℃ 30 s,29個(gè)循環(huán);最后72℃10 min;反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將驗(yàn)證正確的PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體于16℃連接過夜,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中,將PCR和雙酶切鑒定正確的克隆菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,并命名為pMD18-T-TsGLS和pMD18-T-Ts-GAPDH,利用生物軟件進(jìn)行序列比對(duì),將陽(yáng)性菌液-80℃凍存[6]。

使用全式金生物技術(shù)有限公司的柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒,用分光光度計(jì)測(cè)定上述兩種質(zhì)粒的濃度。將質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋5個(gè)梯度,分裝后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用稀釋好的不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品為模板,PCR的反應(yīng)條件依照SYBR?PremixEx TaqTMII試劑盒推薦的方法:反應(yīng)體系為20 μL,SYBR?PremixEx TaqTMII(Tli RnaseH Plus)10 μL,上 下 游 引 物 各 0.5 μL,ROX Reference Dye II 0.4 μL,稀釋后的模板 0.5 μL,ddH2O 8.1 μL。 反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s;60℃退火34 s;40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析。以其模板質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度(lg)作為X軸,其所對(duì)應(yīng)的Ct值作為Y軸,即可得出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

1.5.3待測(cè)樣品的檢測(cè) 將各組樣品逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板,每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)反應(yīng),分別以TsGLS和TsGAPDH為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.6數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用EXCEL、SPSS 21.0和Image J軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

1.7酸性條件旋毛蟲免疫熒光信號(hào)檢測(cè) 分別將pH值2.5生理鹽水培養(yǎng)3 h(酸處理組)與pH值6.6生理鹽水培養(yǎng)3 h(正常組)的旋毛蟲進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。吸取少量旋毛蟲于粘附載玻片,用蓋玻片輕輕按壓后,4%多聚甲醛處理10 min,4℃預(yù)冷甲醇5 min,PBS洗3次每次10 min。1%Triton X-100處理5 min后用山羊血清封閉1 h。一抗用自制的 TsGLS多克隆抗體孵育(1∶1 000),二抗用FITC標(biāo)記山羊抗兔(1∶1 000)?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄笥跓晒怙@微鏡下觀察,圖像采集時(shí)保證所有參數(shù)一致。

2　結(jié)果

2.1TsGLS基因片段的擴(kuò)增和pMD18-T-TsGLS重組質(zhì)粒的鑒定 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,獲得大小為149 bp的基因片段,與預(yù)期目的基因大小相符(圖1)。目的基因克隆后進(jìn)行酶切鑒定與測(cè)序,證實(shí)該插入片段與TsGLS基因序列一致。

圖1　TsGLS基因PCR產(chǎn)物

圖2　TsGAPDH基因PCR產(chǎn)物

2.2TsGAPDH基因片段的擴(kuò)增和pMD18-T-Ts-GAPDH重組質(zhì)粒的鑒定 提取肌幼蟲總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增TsGAPDH目的片段,大小為92 bp,與預(yù)期目的基因大小相符(圖2)。目的基因克隆后進(jìn)行酶切鑒定與測(cè)序,證實(shí)結(jié)果與預(yù)期一致。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別以pMD18-T-TsGLS及pMD18-T-TsGAPDH重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。將兩種標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋,根據(jù)其模板數(shù)與Ct值之間存在的線性關(guān)系(y代表Ct值;x代表起始模板數(shù)),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,直線回歸方程如下:

TsGLS mRNA:y=-3.3260x+10.1010(R2=0.999),TsGAPDH mRNA:y=-3.2630x+12.1440(R2=1)。

結(jié)果顯示,這兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致系數(shù)R2均接近1.000,TsGLS和 TsGAPDG擴(kuò)增效率分別為99.81% 和 102.53%,在 0.8 ～ 1.2 之間,都接近100%,符合△△Ct法相對(duì)定量分析的標(biāo)準(zhǔn),因此本實(shí)驗(yàn)采用△△Ct法進(jìn)行表達(dá)差異分析[8]。

圖3　TsGLS基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4　TsGAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4不同pH值對(duì)TsGLS mRNA表達(dá)水平的影響

利用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)酸性條件下培養(yǎng)的肌幼蟲TsGLS的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),得到各檢測(cè)樣品Ct值,以pH值6.6生理鹽水培養(yǎng)0.5 h的肌幼蟲相對(duì)表達(dá)量作為空白對(duì)照組,△△Ct法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

如圖5 所示,pH 值 2.5、pH 值 4.0、pH 值 6.6和pH值9.0 TsGLS mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)相似,在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),隨著pH值的降低,TsGLS mRNA表達(dá)量逐漸升高,pH值2.5時(shí)TsGLS mRNA表達(dá)量顯著高于其他各組(P＜0.01);在0.5 h和1 h 時(shí),pH 值4.0、pH 值6.6、 pH 值9.0 三組之間相比較,TsGLS mRNA表達(dá)量變化差異并不顯著(P＞0.05);在3 h時(shí),pH值4.0相比pH值6.6和pH值9.0有明顯升高。在pH值相同時(shí),TsGLS mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈升高趨勢(shì),且在pH值2.5條件下培養(yǎng)3 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高。

2.5酸性條件旋毛蟲免疫熒光信號(hào)強(qiáng)度分析 免疫熒光信號(hào)顯示,酸處理組的旋毛蟲在熒光顯微鏡下顯示出明顯的綠色熒光,而正常組的旋毛蟲熒光信號(hào)較弱,明顯暗于酸處理組(見中插彩版圖6)。

圖5　不同pH值對(duì)TsGLS mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

將兩組圖片分別經(jīng)Image J軟件分析后,計(jì)算各組旋毛蟲肌幼蟲光密度平均值,發(fā)現(xiàn)酸處理組明顯高于正常組,差異極顯著(P＜0.01)(表1)。

表1　TsGLS熒光信號(hào)光密度平均值分析

3　討論

Gorden等人[9]將細(xì)菌的抗酸性定義為細(xì)菌暴露在低于pH值2.5的環(huán)境下2 h后,存活率超過10%,即認(rèn)為其具有抗酸能力。旋毛蟲作為一種食源性病原體,對(duì)胃酸具有一定的耐受能力。在pH值2.5條件下培養(yǎng)旋毛蟲3 h時(shí),旋毛蟲仍有45%的存活率[10]。

傳統(tǒng)的旋毛蟲收集方法是將小鼠肌肉攪碎后用人工胃液消化,經(jīng)貝爾曼氏裝置收集。為避免人工胃液的酸性環(huán)境對(duì)旋毛蟲的刺激作用,我們將小鼠肌肉攪碎后直接在顯微鏡下挑取,保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。將獲得的旋毛蟲在酸性條件下培養(yǎng)后,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),酸性條件能夠明顯誘導(dǎo)旋毛蟲體內(nèi)谷氨酰胺酶的表達(dá)。且在與胃酸接近的pH值2.5時(shí),谷氨酰胺酶的表達(dá)量有著明顯的升高。此外,熒光信號(hào)分析也顯示,pH值2.5生理鹽水培養(yǎng)后的旋毛蟲熒光強(qiáng)度明顯高于pH值6.6生理鹽水組,表明在酸性組中旋毛蟲谷氨酰胺酶含量明顯升高。谷氨酰胺依賴型抗酸系統(tǒng)是大腸桿菌體內(nèi)重要的抗酸系統(tǒng)之一,Lu Peilong等人研究發(fā)現(xiàn),在極酸性培養(yǎng)基中(pH值2.5)培養(yǎng)大腸桿菌時(shí),單獨(dú)加入谷氨酰胺即可保持細(xì)菌較高的存活率[11]。谷氨酰胺在肉類、蔬菜、水果等食物中均具有很高的含量,大腸桿菌利用氨基酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GadC吸收Gln,胞內(nèi)的谷氨酰胺酶(YbaS)催化 Gln水解為谷氨酸(Glu)和NH3并消耗H+;Glu被GadC轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外并繼續(xù)轉(zhuǎn)入Gln。谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)和水解過程能夠幫助大腸桿菌維持體內(nèi)的酸堿平衡[3、12]。本研究結(jié)果揭示,谷氨酰胺酶對(duì)旋毛蟲耐受酸性環(huán)境具有重要作用,旋毛蟲存在類似大腸桿菌的谷氨酰胺依賴型抗酸系統(tǒng)來保護(hù)酸性環(huán)境對(duì)其自身?yè)p傷。