劉志玲,陳 茹,朱道中,吳曉薇,林志雄,田純見,羅 瓊,段燕喻

(廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510623)

病毒性出血性敗血癥(Viral haemorrhagic septicaemia,VHS)是感染鱒魚及其他鮭科魚類、大菱鲆等多種海水魚類引起一種嚴(yán)重的致死性傳染性疾病。其病原是彈狀病毒科粒外彈狀病毒屬的病毒性出血性敗血病毒(VHSV)[1]。該病主要病理變化為組織器官出血、變性、壞死。肝、腎是靶器官,細(xì)胞出現(xiàn)空泡化或固縮化[2]。死亡率可達(dá)到90% ～100%,對(duì)世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病最早發(fā)現(xiàn)于歐洲大陸及北美洲[3]。

VHS是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)[4]、亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心(NACA)規(guī)定的必須通報(bào)的疫病,同時(shí)也是我國(guó)規(guī)定的進(jìn)境必檢疫病。國(guó)際組織通常對(duì)VHS感染國(guó)家水產(chǎn)品貿(mào)易采取一些限制措施,從而避免帶病魚類流動(dòng)到其他國(guó)家和地區(qū)。VHS主要流行于北美洲和歐洲一些國(guó)家。迄今為止我國(guó)關(guān)于VHS暴發(fā)的報(bào)道極少,但隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展和同國(guó)際上水產(chǎn)貿(mào)易的急劇增加,該病對(duì)我國(guó)魚類養(yǎng)殖業(yè)形成很大的威脅[5]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)VHSV的檢測(cè)方法大致可分為兩大類:分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法。其中分子生物學(xué)方法主要包括 RT-PCR[6]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[7]、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法[8]、焦磷酸測(cè)序技術(shù)[9]、液相芯片檢測(cè)技術(shù)等[10];免疫學(xué)方法主要包括中和試驗(yàn)[11]、免疫熒光[12]、酶聯(lián)免疫吸附[13-14]等。

分子生物學(xué)檢測(cè)方法耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病檢測(cè)?！禣IE水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》也推薦RT-PCR及熒光RT-PCR等方法檢測(cè)VHS。但是由于VHS在國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)較少,且活病毒的流通存在生物安全風(fēng)險(xiǎn),陽(yáng)性物質(zhì)的缺乏制約了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的推廣,因此急需構(gòu)建安全、可靠的陽(yáng)性核酸物質(zhì)。

本研究根據(jù)《OIE水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》推薦的VHS分子生物學(xué)檢測(cè)方法,利用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)制備了VHSV核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),并從均一性、穩(wěn)定性和定值等幾個(gè)方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研制的陽(yáng)性核酸物質(zhì)不僅可以為VHS檢測(cè)提供陽(yáng)性質(zhì)控,同時(shí)也可以用于不同試劑、設(shè)備以及不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果驗(yàn)證和比對(duì),消除檢測(cè)間的差異,使其結(jié)果具有溯源性。

1　材料與方法

1.1菌毒株及載體 VHS病毒為深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植食檢測(cè)中心水生實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送;pGEM-T Easy Vertor System II載體,Promega公司產(chǎn)品;JM109大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2主要試劑 RNA提取試劑盒,Promega公司產(chǎn)品;一步法RT-PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶NdeI,TaKaRa公司產(chǎn)品;DNA膠回收試劑盒,Axygen公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、RNA純化試劑盒,北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ribo-MAXTM Large Scale RNA Production System-T7),Progema公司產(chǎn)品。

1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備用毒株的鑒定 VHSV滅活病毒懸液由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家水生動(dòng)物疫病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。采用OIE水生動(dòng)物疫病檢測(cè)手冊(cè)(第2.3.9章)推薦的常規(guī)RT-PCR方法鑒定,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定后與GenBank登錄的序列進(jìn)行同源性比對(duì),確認(rèn)毒株為VHSV。將該毒株用作VHSV核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。

1.4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

1.4.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù) GenBank登錄的VHSV毒株的序列以及《OIE水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》推薦的VHSV檢測(cè)方法,設(shè)計(jì)用于克隆VHSV NN基因的特異性擴(kuò)增引物,引物序列見表1,并由ThermoFisher公司合成。對(duì)病毒核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。將序列正確的基因片段連接于pGEM-Teasy載體,轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,挑取白色菌落,經(jīng)RT-PCR鑒定及序列測(cè)定鑒定為陽(yáng)性后,用天根生化科技(北京)有限公司的高濃度質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。該重組質(zhì)粒命名為pGEM-N。

表1　引物和預(yù)期片段大小

1.4.2目標(biāo)基因的體外轉(zhuǎn)錄 選擇重組質(zhì)粒中位于NNV RNA2基因下游的Nde I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)對(duì)pGEM-N進(jìn)行單酶切。以線性化的質(zhì)粒為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,體外轉(zhuǎn)錄體系如下:T7 Transcription 5 × Buffer,20 μL;dNTPs(25 mmol/L),30 μL;線性化質(zhì)粒,5-10 μg;Enzyme Mix(T7),10 μL;去離子水,40 μL;總體積為100 μL。 反應(yīng)條件為37℃溫浴5 h。然后向反應(yīng)體系中加入10 μL DNA酶,37℃溫浴15 min除去DNA模板。最后用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的RNA純化試劑盒提取純化。將RNA沉淀溶于RNase-Free H20中,得到制備好的N-cRNA片段。

1.4.3N-cRNA純度及含量測(cè)定 將上述制備好的N-cRNA作100倍稀釋后用NanoDrop 1000紫外分光儀測(cè)定其在波長(zhǎng)260 nm與280 nm處的OD值,以分析其純度和濃度。OD260/OD280值在1.8～2.0則RNA的純度較高,比值低于1.8,說(shuō)明RNA樣品有雜質(zhì)污染。同時(shí)根據(jù)單鏈RNA的相對(duì)分子質(zhì)量(MW),按下式計(jì)算N-cRNA的拷貝數(shù)濃度?？截悢?shù)(copies/μL)=(6.02 ×1023拷貝數(shù)/摩爾) ×(濃度g/μL)/(分子量 g/mol)。

1.4.4N-cRNA的稀釋與分裝保存 制備的N-cRNA用系列稀釋成108～104copies/μL,采用熒光RT-PCR方法測(cè)定各濃度Ct值,從而獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程。108copies/μL濃度的樣品混勻后分裝入凍存管,每管1.0 mL,分裝300管,分別保存于室溫(20℃ ～25℃)、冰箱冷藏(2℃ ～8℃)、-20℃,每個(gè)溫度下保存20支,剩余的保存于-80℃。

1.5標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)分析

1.5.1均勻性試驗(yàn) 隨機(jī)從-80℃保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)抽取10支樣品,編號(hào)后用《OIE水生動(dòng)物疫病檢疫手冊(cè)》2.3.9章中VHS熒光RT-PCR方法檢測(cè),進(jìn)行Ct值標(biāo)定,計(jì)算批間不精密度,該檢測(cè)為一次操作,一次上機(jī)完成。批內(nèi)不精密度的分析方法是將10支樣品分別抽取10 μL進(jìn)行混合,混合后分別用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)10次。

1.5.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 從已分裝好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取樣品按以下保存條件保存,每種條件保存4支。保存條件:(1)室溫(20℃ ～25℃),相對(duì)濕度20% ～25%,7 d;(2)冰箱冷藏(2℃ ～8℃),1個(gè)月;(3)-20℃,6個(gè)月;(4)-80℃(不同條件下穩(wěn)定性對(duì)照組)。取不同條件下的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分別用OIE推薦的VHS熒光RT-PCR方法檢測(cè),進(jìn)行Ct值標(biāo)定,觀察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1.5.3定值檢測(cè)與協(xié)作標(biāo)定 采用熒光RT-PCR檢測(cè)方法,并聯(lián)合7家其他權(quán)威實(shí)驗(yàn)室對(duì)制備好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值。定值方法為將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物和已知量值的病毒核酸樣品在相同的實(shí)驗(yàn)條件下分別進(jìn)行熒光定量RT-PCR,在對(duì)候選物定性檢測(cè)的基礎(chǔ)上,用已知量值病毒核酸樣品測(cè)定的Ct值(循環(huán)閾值)對(duì)所含模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值做線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程,以此方程計(jì)算獲得候選物的核酸量值,單位為copies/μL。

1.5.4不確定度分析 通過(guò)對(duì)實(shí)際檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行分析,綜合考慮人員操作者、設(shè)備和試劑帶來(lái)的誤差,確定標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度。應(yīng)用不確定度的A類評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)定。

2　結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備用毒株的鑒定和篩選 備用毒株經(jīng)OIE推薦的常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法鑒定為陽(yáng)性,且反應(yīng)結(jié)果特異、敏感,符合核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備用毒株的要求。序列分析表明,所擴(kuò)增的片段與GenBank登錄的其他VHSV毒株同源性均達(dá)90%以上,表明克隆所得到的 N基因可以有效代表VHSV的核苷酸序列,可用作核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。

2.2N基因片段的擴(kuò)增 提取VHS病毒RNA,利用所合成的引物擴(kuò)增N基因序列,RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后觀察結(jié)果(圖1),擴(kuò)增所得片段與預(yù)期大小相符。

2.3N-cRNA純度及含量測(cè)定 將體外轉(zhuǎn)錄合成的cRNA測(cè)定其260 nm與280 nm的吸光度值(OD值),N-cRNA,OD260/OD280值 =1.97。 表明轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cRNA純度較高。依據(jù)所轉(zhuǎn)錄的單鏈RNA樣品的分子質(zhì)量和濃度計(jì)算獲得cRNA樣品的拷貝數(shù)。結(jié)果見表2。

圖1　VHSV N基因的PCR擴(kuò)增

表2　N-cRNA純度及含量測(cè)定

2.4N-cRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取稀釋成8.41×108～8.41×104copies/μL各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),每個(gè)濃度設(shè)兩個(gè)重復(fù),進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)定Ct值。根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值的相關(guān)性,由SDS軟件 2.1得標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=-3.773X+49.981。 相關(guān)度 R2=0.994(見圖 2)。

圖2　不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性試驗(yàn) 對(duì)隨機(jī)抽取的10支標(biāo)準(zhǔn)樣品與混合后的10支標(biāo)樣進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)(圖3),并將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差分析(F檢驗(yàn)法),計(jì)算管間變異系數(shù)和批內(nèi)均勻性,根據(jù)自由度及給定的顯著性水平α,查表得臨界的Fα值,再與公式算得的F值進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,F＜Fα,表明分裝的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)其組內(nèi)與組間無(wú)明顯結(jié)果差異,具有良好的均勻性。結(jié)果見表3。

圖3　N-cRNA核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性試驗(yàn)結(jié)果

2.6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn) 取不同保存條件下的N-cRNA,并將檢測(cè)組與對(duì)照組(-80℃)進(jìn)行Ct測(cè)定,數(shù)據(jù)分別作t檢驗(yàn),結(jié)果各檢測(cè)組t值均小于t檢驗(yàn)的臨界值(表4),表明各檢測(cè)組在穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)期內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值檢測(cè)與協(xié)作標(biāo)定 本次定值聯(lián)合8家單位參加協(xié)作標(biāo)定,采用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度,根據(jù)片段長(zhǎng)度換算拷貝數(shù)和協(xié)作標(biāo)定的方式,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量(copies/μL)。8家單位采用統(tǒng)一的試驗(yàn)方案和結(jié)果分析程序,分別取得3次獨(dú)立的有效結(jié)果,其結(jié)果與研制單位的標(biāo)定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析獲得平均值,結(jié)果見表5。

2.8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度分析 通過(guò)對(duì)實(shí)際檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行分析,確定標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度,包括:分析測(cè)定誤差、RNA提取過(guò)程的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。定值方法應(yīng)用A類評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)定,經(jīng)計(jì)算N-cRNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度為0.149×108copies/μL,定值為(6.625 ±0.149) ×108copies/μL,結(jié)果見表5。

表3　VHSV核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(N-cRNA)均勻性試驗(yàn)結(jié)果

表4　VHSV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不同保存條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

在動(dòng)物病毒檢測(cè)方法中,分子生物學(xué)檢測(cè)方法因特異性強(qiáng)、敏感性好是目前最為常用的方法之一。陽(yáng)性質(zhì)控用于驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性,對(duì)PCR試驗(yàn)的質(zhì)量控制有至關(guān)重要的作用。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)屬于生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一種,可作為核酸擴(kuò)增技術(shù)的陽(yáng)性質(zhì)控品,在促進(jìn)病原核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化及提高檢測(cè)一致性和準(zhǔn)確性方面發(fā)揮了重要作用。與重組質(zhì)粒相比,本研究利用體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可在擴(kuò)增檢測(cè)的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量控制,更符合RNA病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求[15]。

表5　VHSV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果

由于VHS目前在我國(guó)內(nèi)報(bào)道極少,大部分實(shí)驗(yàn)室由于缺乏病毒陽(yáng)性質(zhì)控制約了檢測(cè)能力的建立。本研究構(gòu)建基于VHSV N基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無(wú)生物安全風(fēng)險(xiǎn),不易對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和環(huán)境造成交叉污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,在實(shí)際檢測(cè)中具有很好的適用性。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),也可用于不同實(shí)驗(yàn)室間、不同人員、不同試劑的比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在我國(guó)各檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室及各地方水產(chǎn)技術(shù)推廣站的推廣應(yīng)用,將可推進(jìn)我國(guó)VHSV檢測(cè)盡早達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化,提升疫病防控把關(guān)能力。