李華瑋,姬鵬超,王永芬,趙緒永,何 健,趙孟孟

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程學院,河南 鄭州 450046;2.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種造成母豬流產(chǎn)、死胎、仔豬呼吸道感染等死亡率較高的疾病,該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)。該病1987年首次在美國報道,隨后世界蔓延,我國在1996年報道該病[1],2006年暴發(fā),致大量豬群死亡,2015年又出現(xiàn)新的亞型[2]。對于該種傳染病一直未有有效的藥物和疫苗。

該病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp9蛋白是主要編碼RNA依賴的RNA聚合酶的功能蛋白,該蛋白僅在病毒復制時出現(xiàn),對診斷滅活苗與弱毒苗具有重要意義[3-5]。之前有文獻報道Nsp9基因與病毒毒力相關(guān),并且該基因上存在T細胞和B細胞表位[6-8],與病毒抗利巴韋林耐藥性相關(guān)[9],Nsp9基因與宿主多種蛋白互相作用促進病毒復制[10-13],并且將弱毒株Ch-1R的Nsp9基因替換到強毒株XH-GD的感染性克隆上,可提高其親本毒株的滴度[14]。

研究結(jié)果表明,強弱毒株的Nsp9基因之間存在12個氨基酸突變[15],究竟是哪一個氨基酸與病毒復制相關(guān)尚未可知。本研究在之前構(gòu)建的PRRSV的XH-GD感染性克隆基礎上,通過融合PCR方法設計突變質(zhì)粒,使Nsp9蛋白第642位氨基酸由組氨酸突變?yōu)槔野彼?其中感染性克隆骨架為強毒株XH-GD,該毒株第642位氨基酸為組氨酸。2006年之前的弱毒株的Nsp9基因第642位氨基酸為酪氨酸。本研究的目的是探索Nsp9基因第642位氨基酸突變之后對病毒復制的影響。結(jié)果表明,突變之后病毒滴度未有顯著變化,第642位氨基酸不是決定病毒滴度的關(guān)鍵氨基酸,與Nsp9基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

1　材料與方法

1.1細胞、菌株和載體 BHK細胞、Marc-145細胞、含有PRRSV XH-GD骨架的感染性克隆pOKA2BCD為農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室保存;大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2主要試劑與儀器 DMEM以及2xMEM胎牛血清,購自GIBCO公司;AclⅠ、NheⅠ內(nèi)切酶,購自Thermo Scientific公司;Platinum pfx DNA聚合酶、TRIZol?Reagent,購自 Invitrogen公司;Cy3標記的山羊抗鼠二抗,購自博奧森生物科技有限公司;N蛋白單抗,購自美國VMRD公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司。熒光定量儀器,購自美國ABI公司。

1.3突變質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1含有突變位點的引物設計 利用Oigo6設計突變氨基酸Y到H的兩對引物,其中第一對擴增A片段上游引物AF序列為5′-TGACTGCCAAAGAACTGGAGAAAC-3′,下游引物AR序列為5′-CTCAGGATTGGACCTGAGTTTTTCCCACATGGA-3′;第二對擴增 B片段上游引物 BF序列為 5′-TCCATGTGGGAAAAACTCAGGTCCAATCCTGAG-3′,下游引物 BR序列為5′-AGATGTTCTGCCCGAACCTCC-3′,該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.3.2PCR擴增 分別以 pOK-A2BCD質(zhì)粒為模板,以AF和AR為引物擴增A片段,以BF和BR為引物擴增B片段,用DNA純化試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit對 PCR 產(chǎn)物進行回收純化,再以回收的純化產(chǎn)物為模板,以AF和BR為引物擴增得到目的片段,用 DNA純化試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit對 PCR 產(chǎn)物進行回收純化。

1.3.3目的片段的酶切與連接 將純化的目的片段進行AclⅠ、NheⅠ雙酶切,酶切之后回收,與酶切過的載體連接,4℃過夜,轉(zhuǎn)到到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中,篩選陽性菌,37℃過夜搖菌,提取質(zhì)粒。

1.4病毒的拯救 將含有病毒全長的感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細胞,參照Lipofectamine 2000說明書。24 h之后收獲細胞,反復凍融,命名為P0。將凍融后的細胞離心,用上清感染長滿單層的Marc-145細胞,用血清含量為2%DMEM維持液孵育細胞,48 h之后觀察細胞病變,如有病變,參照同樣的方法繼續(xù)往下傳代,命名為XH-GD-Y642H,代次為P1-P3代。

1.5拯救病毒的PCR鑒定 為了驗證觀測細胞病變非污染親本毒,引入沉默突變FseⅠ酶切位點來進行鑒定,在兩側(cè)設計引物進行測定,引物序列:Det-F:5′-CTGAGCTTGGGGTGCTG-3′;Det-R:5′-ATGGCGAATTTCTTTGTACTG-3′。 RNA 提取參照TRIZol?Reagent RNA提取試劑的使用說明書操作,反轉(zhuǎn)錄參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書。將得到的PCR純化產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。

1.6拯救病毒的間接免疫熒光鑒定 將拯救病毒第三代以MOI=1的劑量接種Marc-145細胞,感染之后24 h多聚甲醛固定30 min,之后以PRRSV N蛋白單抗為一抗在37℃孵育1 h,PBS清洗3次,之后以1∶200稀釋的cy3標記的山羊抗鼠二抗室溫孵育1 d,最后PBS清洗3次,在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。

1.7拯救病毒的TCID50測定 測定rXH-GD-642第3代病毒和親本毒rXH-GD第3代病毒的滴度。

操作步驟:用rXH-GD-642第3代病毒和親本毒rXH-GD第3代病毒,以MOI=1的劑量感染Marc-145和PAM細胞,分別在48 h采集上清液。采集上清液之后加入等量的含2%胎牛血清的維持液,將取出的樣品進行TCID50測定。

1.8熒光定量測定Nsp9轉(zhuǎn)錄水平 將前述2種病毒以MOI=1的劑量感染Marc-145細胞,24 h采集細胞,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄,以Nsp9引物進行熒光定量PCR,內(nèi)參為GAPDH,具體參照文獻[16]。

1.9噬斑試驗 將拯救出來的病毒第3代倍比稀釋,感染Marc-145細胞,1 h之后加入終濃度2%胎牛血清和1%瓊脂糖的MEM營養(yǎng)液,48 h后,0.5%結(jié)晶紫染色液染色。

1.10數(shù)據(jù)分析 TCID50結(jié)果采用GraphPad Prism軟件進行分析,P＜0.05視為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1含有突變位點質(zhì)粒的構(gòu)建 以感染性克隆模板質(zhì)粒為模板進行融合 PCR擴增,分別得到了1 500 bp和600 bp左右的A片段和B片段,以上回收的PCR為模板,重新進行新的擴增得到含有突變位點的PCR片段,將該PCR片段進行回收,AclⅠ、NheⅠ雙酶切之后連接之前酶切過的感染性克隆產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化之后進行菌液PCR鑒定陽性質(zhì)粒。將陽性菌液送公司測序,測序結(jié)果與預期一致,表明質(zhì)粒構(gòu)建正確,如圖1所示。

圖1　突變位點峰

2.2替換病毒的拯救與鑒定 轉(zhuǎn)染之后接種Marc-145細胞,第一代即出現(xiàn)細胞病變,已穩(wěn)定傳至第3代。用鑒別引物進行擴增,得到目的片段,結(jié)果見圖2。測序結(jié)果表明,仍具有引入的沉默突變,非污染親本毒。

間接免疫熒光試驗結(jié)果,可見在兩種拯救病毒感染的細胞上均有紅色可見熒光,進一步表明病毒拯救成功,結(jié)果見圖3。

圖2　菌液PCR擴增

2.3拯救病毒的生物學特性 用MOI=1的劑量接種拯救病毒XH-GD-Y642H或親本毒XHGD感染Marc-145細胞和PAM細胞48 h,收集上清進行 TCID50測定。結(jié)果表明,rXH-GD-

圖3　兩種拯救病毒免疫熒光實驗結(jié)果

Y642H和rXH-GD的滴度差異不明顯,結(jié)果見圖4和圖5。

圖4　兩種病毒在Marc-145細胞上的滴度變化

圖5　兩種病毒在PAM的滴度變化

2.4噬斑試驗結(jié)果 噬斑試驗結(jié)果表明,突變之后的病毒噬斑大小與原病毒相比差異不大,見圖6。

圖6　兩種病毒的噬斑大小

2.5Nsp9轉(zhuǎn)錄水平 在病毒感染細胞24 h之后,采集樣品進行Nsp9相對表達量的測定,結(jié)果表明,突變之后病毒Nsp9的mRNA水平有所下降,差異顯著,見圖7。

圖7　兩種病毒的轉(zhuǎn)錄水平比較

3　討論

之前的研究結(jié)果表明Nsp9主要定位在細胞質(zhì),病毒感染會引起該蛋白向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,并且表達量逐步升高,強弱毒株存在12個氨基酸突變,將弱毒Nsp9替換到強毒感染性克隆上可以提高病毒滴度。基于此項結(jié)論,將強毒株的突變位點組氨酸,替換為弱毒株的位點酪氨酸,經(jīng)過病毒拯救之后發(fā)現(xiàn),病毒滴度沒有發(fā)生明顯升高,推測病毒的滴度與第642位氨基酸無顯著關(guān)系。本試驗采用的感染性克隆第642位點初始為組氨酸,突變?yōu)槿醵局甑睦野彼?至于突變?yōu)槠渌被崾欠駮绊懖《镜牡味群筒《镜膹椭七€需要進一步的試驗驗證。本試驗結(jié)果表明,突變之后病毒粒子的噬斑大小未發(fā)生變化,病毒Nsp9基因的轉(zhuǎn)錄水平有所下降,分析其原因是由于突變之后改變了病毒蛋白的三級結(jié)構(gòu),間接影響了病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄。與PRRSV同屬的馬動脈炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)、小鼠乳酸脫氫酶升高征病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)以及猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fevervirus,SHFV)的聚合酶蛋白上,該位點是天門冬氨酸,而不是酪氨酸或者組氨酸,如人工將PRRSV第642位點突變?yōu)樘扉T冬氨酸,是否會導致其他生物學特征產(chǎn)生變化,還需要進一步通過反向遺傳學驗證。

之前有報道在通過反向遺傳學突變的PRRSV其他蛋白(Nsp7、GP5a等),會引起對病毒致死突變或者降低病毒滴度或者轉(zhuǎn)錄[17],本試驗結(jié)果與之前保持一致。據(jù)此推測只要不破壞病毒基因的高級結(jié)構(gòu)就不會造成病毒致死突變。這一點需通過密碼子優(yōu)化方法進行進一步測試并進一步證明關(guān)鍵氨基酸的作用及其對病毒生物學特性的影響。

Nsp9不僅與宿主蛋白發(fā)生作用,而且與病毒毒力,耐藥性,IFN-γ等密切相關(guān)。已有報道針對Nsp9設計相應的化合物會抑制病毒復制[18-21],PRRSV在全國范圍內(nèi)突變?nèi)找鎳乐?而Nsp9突變較其他基因較保守,這也為未來研究該基因以及控制該病奠定了新的方向。本研究為進一步探索病毒Nsp9的復制機理與調(diào)控機制奠定了基礎。