劉曉靜,鄭世民,孫正陽,高雪麗,呂曉萍,劉超男

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種以結(jié)腸和直腸病變?yōu)橹鞯姆翘禺愋匝装Y性疾病。以持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便為主要臨床癥狀。近年來UC在我國的發(fā)病率逐漸升高,但其病因和發(fā)病機制仍不明確,關(guān)于UC發(fā)病機制的研究主要集中在遺傳與易感性、免疫異常、腸道菌群的改變等方面[1]。國內(nèi)外一直以化學(xué)藥物、激素以及免疫抑制劑等藥物對UC患者進行治療,但是此類藥物只能通過抑制炎癥和免疫反應(yīng)暫時控制和緩解疾病癥狀,而不能起到根治的作用,停藥后容易復(fù)發(fā),且長期服藥會影響機體的免疫功能,對機體造成損傷。嗜酸乳桿菌是腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群,粘附于腸上皮細(xì)胞,形成生物學(xué)屏障,增強機體免疫力[2]。近年來國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過動物實驗以及臨床實驗證實嗜酸乳桿菌在UC治療中能夠起到重要作用,但其機制尚不明確。UC是一種炎癥性腸病,而Toll樣受體(Toll-like receptor,TLRs)能通過多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),因此 UC患者體內(nèi) TLRs表達的研究逐漸受到重視,已有研究表明,UC患者TLR2高表達,且隨病情加重,表達量升高[3]。也有學(xué)者研究證實,益生菌可以降低 UC大鼠結(jié)腸組織中TLR2的表達,并提出益生菌在緩解大鼠UC癥狀中TLR可能發(fā)揮重要作用[4]。此外,炎性細(xì)胞因子在炎癥性疾病中具有重要作用,可以相互作用影響炎癥進程。因此,本實驗應(yīng)用嗜酸乳桿菌預(yù)防雛雞UC的發(fā)生,檢測不同時期各組雛雞血清中IL-8和IL-10含量以及結(jié)腸組織 TLR2和 MyD88 mRNA表達量,探討嗜酸乳桿菌在預(yù)防雛雞UC中的作用及其機制,為嗜酸乳桿菌等微生態(tài)制劑在臨床上治療和預(yù)防UC等腸道疾病的應(yīng)用提供重要的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 75只1日齡SPF雛雞,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2主要試劑和儀器 乳酸桿菌 LA(丹麥科漢森有限公司);2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(德國Sigma公司);TLR2抗體(北京博奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);免疫組化檢測試劑盒,DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);IL-8 ELISA試劑盒,IL-10 ELISA試劑盒(北京誠林生物技術(shù)有限公司);切片機(美國Thermo Fisher Scientific有限公司);LightCycler 2.0熒光定量 PCR儀(美國羅氏公司)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物分組與處理 將75只1日齡 SPF雛雞隨機分為嗜酸乳桿菌預(yù)處理組(LA+UC組)、模型組(UC組)和對照組(C組)3組,每組25只雛雞。3組雛雞從1日齡開始經(jīng)口灌服微膠囊,連續(xù)3 d,1次/d。LA+UC組雛雞灌服嗜酸乳桿菌微膠囊,其余兩組雛雞灌服空微膠囊。15日齡對3組雛雞進行灌腸,劑量為100 mg/kg體重,LA+UC組和UC組雛雞灌腸液為TNBS乙醇混合液,C組雛雞灌腸液為生理鹽水。 灌腸后 1、3、5、7、9、11 d,每組分別取3只雛雞,心臟采血并分離血清,取結(jié)腸組織,部分-80℃凍存,部分固定于10% 中性福爾馬林溶液中。

1.2.2檢測指標(biāo)和方法

(1)組織病理學(xué)檢查:取固定24 h結(jié)腸組織修塊,水洗24 h、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,厚度為4 μm,常規(guī) H.E.染色,封片,光學(xué)顯微鏡下觀察,病理成像系統(tǒng)分析。

(2)TLR2和 MyD88 mRNA表達量檢測:提取-80℃低溫冰箱凍存的結(jié)腸組織中總RNA,采用熒光定量PCR方法檢測結(jié)腸組織中TLR2和MyD88 mRNA表達量。根據(jù)比較閾值法計算出目的基因的相對含量。

(3)血清中 IL-8和 IL-10含量檢測:采用ELISA方法檢測血清中IL-8和IL-10含量。根據(jù)IL-8和IL-10 ELISA檢測試劑盒說明書進行操作,用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸計算血清中 IL-8、IL-10含量。

1.2.3統(tǒng)計分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,比較各組間差異。所有數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,計量資料比較應(yīng)用t檢驗方法,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果

2.1各組雛雞臨床癥狀和病理變化 造模后UC組雛雞出現(xiàn)采食減少,精神委靡,體重明顯減輕,喜臥,排稀薄糞便,甚至排出血樣糞便,肛門處粘有糞便,3只雛雞死亡;LA+UC組雛雞造模后體重減輕,不喜運動,糞便稀薄并帶有黏液;C組雛雞在整個過程中狀態(tài)良好,未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。對雛雞進行剖檢,可見UC組雛雞結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫,黏膜表面有散在分布的大小不等的潰瘍灶,腸壁粘連,腸道內(nèi)有大量黏液和血性內(nèi)容物;LA+UC組雛雞結(jié)腸黏膜充血水腫較輕,未見明顯壞死灶;C組雛雞結(jié)腸黏膜完整,未見異常。

2.2各組雛雞結(jié)腸組織病理學(xué)變化 H.E.染色結(jié)果顯示,UC組雛雞結(jié)腸黏膜大面積壞死脫落,黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死,隱窩和腺體結(jié)構(gòu)消失;LA+UC組雛雞結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞,黏膜及黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤;C組雛雞結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,無病變(見中插彩版圖1)。

2.3各組雛雞結(jié)腸組織 TLR2、MyD88 mRNA表達變化 通過RT-PCR方法,在UC組、LA+UC組和C組雛雞的結(jié)腸組織中均檢測到TLR2和MyD88 mRNA表達。結(jié)果顯示,UC組雛雞結(jié)腸組織中TLR2 mRNA表達量在TNBS乙醇混合液灌腸后1～7 d顯著或極顯著(P＜0.05或P＜0.01)高于LA+UC組和C組雛雞;而在TNBS乙醇混合液灌腸后1～9 d,UC組雛雞結(jié)腸組織中MyD88 mRNA表達量顯著或極顯著高于LA+UC組和C組雛雞(圖2)。

圖2　各組雛雞結(jié)腸組織TLR2和MyD88表達變化

2.4各組雛雞血清中IL-8和IL-10含量檢測運用ELISA方法對各組雛雞不同時期血清中IL-8和IL-10含量進行檢測,結(jié)果顯示,UC組雛雞TNBS乙醇混合液灌腸后1～11 d,其血清中IL-8含量顯著或極顯著高于LA+UC組和C組雛雞;TNBS乙醇混合液灌腸后1～9 d,LA+UC組雛雞血清中IL-10含量極顯著或顯著高于 UC組雛雞,極顯著高于C組雛雞;C組雛雞在造模后1～7 d,血清中 IL-10含量極顯著低于UC組雛雞(表1)。

表1　各組雛雞血清IL-10和IL-8含量變化

3　討論

UC是一種慢性、反復(fù)發(fā)作的、主要局限于大腸黏膜及黏膜下層的炎癥性腸病。目前,該病發(fā)病機制尚不明確。免疫學(xué)因素一直被認(rèn)為是該病發(fā)生的主要因素,并成為該病研究熱點。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是由一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)維持平衡的,而UC患者這種平衡被打破,腸道黏膜免疫功能紊亂,而腸道黏膜免疫功能紊亂被認(rèn)為是炎癥性腸病炎癥發(fā)生的主要機制[5]。因此,腸道黏膜免疫在 UC發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。嗜酸乳桿菌是腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群,能夠促進腸道內(nèi)菌群平衡,調(diào)節(jié)腸黏膜免疫功能,與腸道黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合,形成生物屏障,減少有害因素對腸道的破壞。國內(nèi)外已大量報道,益生菌與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合應(yīng)用可以增加UC的治療效果[6],但其在預(yù)防雛雞UC中的作用及其機制少有報道。本實驗對3組雛雞臨床癥狀以及結(jié)腸組織病理學(xué)變化進行觀察,UC組雛雞出現(xiàn)體重減輕、腹瀉、喜臥等臨床癥狀,結(jié)腸出現(xiàn)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤和腸黏膜結(jié)構(gòu)不完整等病理變化,而LA+UC組雛雞臨床癥狀和病理損傷程度均低于UC組雛雞,證實嗜酸乳桿菌在預(yù)防雛雞UC中具有重要作用。

促炎性細(xì)胞因子和抑炎性細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)所導(dǎo)致的免疫異常被視為UC發(fā)病的最重要機制之一[7]。UC患者腸道黏膜促炎因子表達升高,抑炎因子分泌相對不足,使腸黏膜產(chǎn)生過強的炎癥反應(yīng),引起腸道損傷[8]。機體與 UC密切相關(guān)的促炎因子主要有 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等,抑炎因子主要有IL-4、IL-10等,它們可同時或相繼、直接或間接作用靶細(xì)胞,形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),在 UC的組織破壞及炎性反應(yīng)中起著重要作用[9]。IL-8對嗜中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的趨化和激活作用,可誘導(dǎo)它們浸潤到炎癥局部,釋放炎性介質(zhì),引起炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落并廣泛損傷,使腸道吸收面積減少,水分不易吸收,造成水樣糞便[10]。IL-10主要通過抑制T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞和肥大細(xì)胞等產(chǎn)生前炎性因子和趨化因子,從而起到抗炎作用[11]。研究表明,當(dāng)機體發(fā)生UC時,IL-8表達量顯著升高,重型UC患者血清中IL-8表達量顯著高于輕中度患者,而血清中IL-10表達量會降低,且病程越重表達量越低[12]。在本實驗中,UC組雛雞血清中 IL-8含量顯著高于C組雛雞,說明UC組雛雞IL-8高表達,促進炎癥反應(yīng),造成雛雞腸道損傷,促進雛雞UC的發(fā)生和發(fā)展。LA+UC組雛雞血清中IL-8含量不同程度低于UC組雛雞,且病變程度相對較輕,說明嗜酸乳桿菌可能通過減少IL-8的合成從而降低炎癥反應(yīng),預(yù)防雛雞UC的發(fā)生和發(fā)展。血清中IL-10的含量檢測結(jié)果顯示,UC組雛雞血清中IL-10含量高于C組雛雞,表明機體在UC發(fā)生時做出相應(yīng)應(yīng)答,但這種應(yīng)答不足以抵抗促炎因子促進炎癥反應(yīng)的作用,造成機體損傷,而 LA+UC組雛雞血清中IL-10的含量不同程度高于UC組和C組雛雞,且LA+UC組雛雞病變程度低于UC組雛雞,證實嗜酸乳桿菌能夠促進抑炎因子IL-10的合成進而減輕炎癥反應(yīng),降低UC對腸道的損傷。

TLRs是重要的介導(dǎo)腸道黏膜先天防御反應(yīng)的介質(zhì),可以選擇性結(jié)合配體,通過信號傳導(dǎo)介導(dǎo)腸道黏膜免疫反應(yīng),在 UC的發(fā)生中具有重要作用[13]。近年來對于 TLRs與 UC發(fā)生的關(guān)系的研究有很多報道,劉翔等實驗證實TLR2在UC患者或者患病模型中高表達[14],但是在雛雞UC的發(fā)生中是否也是如此還未見報道。在本實驗中,RTPCR方法檢測到UC組雛雞TLR2 mRNA表達量均高于C組雛雞和LA+UC組雛雞,說明在雛雞UC中,TLR2表達量升高,并且嗜酸乳桿菌可以降低TLR2的表達。髓樣細(xì)胞分化因子88(MyD88)是TLR信號傳導(dǎo)通路的下游信號因子,在UC大鼠中MyD88表達高于正常組,且含量的高低與炎癥的程度呈正相關(guān)[15]。在本實驗中,UC組雛雞 MyD88 mRNA表達量高于LA+UC組和C組,表明在雛雞發(fā)生UC時MyD88表達量會有所升高,通過嗜酸乳桿菌預(yù)處理可以明顯減輕其表達。同時,在UC組和LA+UC組雛雞中TLR2和MyD88呈相同的變化趨勢,說明在雛雞UC的發(fā)生過程中TLRs/MyD88信號傳導(dǎo)通路可能被激活,TLRs/MyD88信號傳導(dǎo)通路被激活后,可通過調(diào)節(jié)下游核轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的細(xì)胞因子的釋放,從而介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng),而嗜酸乳桿菌可以有效降低TLRs/MyD88 mRNA表達,抑制這一信號傳導(dǎo)通路,進而抑制炎癥反應(yīng),緩解UC造成的損傷。在本實驗中,血清中IL-8含量變化的趨勢與結(jié)腸組織中TLR2和MyD88 mRNA表達量的變化趨勢相一致,而血清中IL-10的含量則與結(jié)腸組織中TLR2和MyD88 mRNA表達量呈負(fù)相關(guān),因此推測嗜酸乳桿菌可能通過抑制 TLR2和MyD88 mRNA表達,抑制TLR2/MyD88信號傳導(dǎo)通路,從而抑制促炎因子IL-8的合成,促進抑炎因子IL-10的合成,起到預(yù)防雛雞UC發(fā)生和降低損傷的作用。

綜上所述,本實驗證實嗜酸乳桿菌可以預(yù)防雛雞UC的發(fā)生以及緩解UC對雛雞造成的損傷。此外,通過對不同組雛雞促炎因子IL-8和抑炎因子IL-10含量及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的檢測,探索了嗜酸乳桿菌在預(yù)防和緩解雛雞UC的發(fā)生和發(fā)展的作用機制,為嗜酸乳桿菌等微生態(tài)制劑在治療腸道疾病的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。