陳思澈， 黨勝春， 張建新， 錢小寶， 任天宇， 孫明明

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，預(yù)后相對(duì)較差[1]。胃腺癌患者死亡率高的主要原因是胃部的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使腫瘤細(xì)胞較易浸潤與轉(zhuǎn)移[2]。胃腺癌是胃癌的一種，由胃腺體細(xì)胞惡變而來，其發(fā)生率占胃惡性腫瘤的95%[3]。胃腺癌的發(fā)生是多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜過程[4]，其病變涉及多種遺傳易感因素以及基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的異常表達(dá)[5]。其中，HMCN1可通過調(diào)節(jié)下游蛋白抑制癌癥的發(fā)生，但其在胃腺癌中的功能尚不明確。HMCN1又稱Fibulin-b,在細(xì)胞胞質(zhì)分裂期促進(jìn)細(xì)胞成熟，在細(xì)胞連接中起穩(wěn)定作用。通過分析癌癥基因圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)的相關(guān)數(shù)據(jù)，可以從基因水平研究腫瘤的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制。因此，本研究通過Cbioportal數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)合Genecards相關(guān)數(shù)據(jù)，分析HMCN1基因與胃腺癌的關(guān)系，進(jìn)一步明確HMCN1對(duì)胃腺癌發(fā)生和發(fā)展的影響。

1 資料與方法

1.1 HMCN1基因在胃腺癌中的表達(dá)以及生存率分析

通過在線的TCGA可視化平臺(tái)，Cbioportal網(wǎng)站(www.cbioportal.org)[6-8]，獲得TCGA數(shù)據(jù)庫中的289例胃腺癌樣本，提取患者相關(guān)資料，應(yīng)用survival選項(xiàng)分析289例樣本中HMCN1表達(dá)與生存時(shí)間的Kaplan-Meier關(guān)系圖；應(yīng)用oncoprint選項(xiàng)分析HMCN1變異情況。

1.2 HMCN1基因在組織中以及不同病理分期胃腺癌組織中的表達(dá)分析

利用基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)網(wǎng)站搜索HMCN1在正常胃腺組織以及胃腺癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)行比較。搜索HMCN1基因在不同病理分期胃腺癌組織中的表達(dá)情況，應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)分析HMCN1的表達(dá)差異。

1.3 HMCN1基因相關(guān)蛋白以及功能分析

通過Genecards查找與HMCN1有關(guān)的蛋白，構(gòu)建相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，查找其中蛋白的功能，并對(duì)其中蛋白進(jìn)行富集分析。并將在Genecards中找到的蛋白整合到cbioportal中進(jìn)行比對(duì)，明確HMCN1相關(guān)蛋白在胃腺癌中的表達(dá)以及變化情況；Cbioportal中蛋白質(zhì)的表達(dá)基于蛋白芯片分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。生存曲線采用Kaplan-Meier分析法，基因表達(dá)采用Log-rank檢驗(yàn)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMCN1在胃腺癌中的突變情況

在289例胃腺癌樣本中有66例(23%)發(fā)生HMCN1基因突變，其中，錯(cuò)義突變43例(15%)，節(jié)段突變23例(8%)。

2.2 HMCN1基因變異與胃腺癌患者生存率的比較

HMCN1變異組總生存時(shí)間長于無變異組(P=0.015 3)，見圖1。HMCN1變異組無病生存時(shí)間與無變異組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.052 3)，表明HMCN1的變異與患者無病生存時(shí)間無關(guān)。見圖2。

圖1 胃腺癌患者HMCN1變異組和非變異組總生存時(shí)間比較

2.3 HMCN1 mRNA在不同組織以及不同病理分期胃腺癌組織中的表達(dá)

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫，搜索到HMCN1 mRNA在胃腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胃腺組織，見圖3。同時(shí)HMCN1在不同病理分期胃腺癌中的表達(dá)情況不同，在Ⅰ期中的表達(dá)明顯低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，見圖4。

圖2 胃腺癌患者HMCN1表達(dá)變異組和非變異組無病生存時(shí)間比較

圖3 HMCN1 mRNA在正常胃腺組織和胃腺癌組織中的表達(dá)

圖4 HMCN1 mRNA在不同病理分期胃腺癌中的表達(dá)

2.4 HMCN1基因相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

應(yīng)用Genecards分析HMCN1基因主要相關(guān)蛋白，包括CTDSPL、DDX1、CLP1、CFB、UBLCP1、CTDSP1、GPD2、SIRPG、PRSS58、CADM2、TSPAN33、KCTD5、KCTD17、KCTD2、GTPBP1、GTPBP2、HABP2、CTDSP2、OVCH1、CTDSPL2、DVL1、DVL2、DVL3、SPOP、CTDNEP1等25種，構(gòu)建獲得HMCN1相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。

將以上蛋白進(jìn)行富集分析，可發(fā)現(xiàn)這些蛋白富集到Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性通路等。見表1。

圖5 HMCN1相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

表1 HMCN1相關(guān)蛋白參與的富集

2.5 HMCN1下游關(guān)鍵分子分析

將HMCN1基因輸入Cbioportal數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)CTDSPL蛋白在胃腺癌中表達(dá)降低，見圖6。

圖6 CTDSPL在胃腺癌組織中的表達(dá)(圖中紅點(diǎn))

3 討論

胃癌發(fā)病率在全國惡性腫瘤中居第2位，僅次于肺癌[9]。國家癌癥研究所(NCI)和國家人類基因組研究所(NHGRI)在2005年發(fā)起的TCGA項(xiàng)目，通過十多年的發(fā)展，收錄了美國和加拿大地區(qū)11 000多個(gè)患者腫瘤組織和與之匹配的正常組織的相關(guān)數(shù)據(jù)，建立了TCGA數(shù)據(jù)庫，其在探尋腫瘤相關(guān)基因的研究中起重要作用。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，HMCN1變異率越高的患者生存時(shí)間越長，由此推測，HMCN1變異是胃腺癌患者預(yù)后良好的標(biāo)志之一，將來可用于臨床的相關(guān)評(píng)估。HMCN1在不同病理分期胃腺癌組織中的表達(dá)也有所不同，由此推測這可能與腫瘤分化程度有關(guān)。

此外，細(xì)胞增殖周期紊亂與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞癌變發(fā)生及發(fā)展具有至關(guān)重要的作用[10]。分析篩選與HMCN1相關(guān)的蛋白，并對(duì)其進(jìn)行富集分析，可發(fā)現(xiàn)這些蛋白富集到Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性通路等生理過程。CTDSPL是HMCN1下游的一個(gè)相關(guān)蛋白，其在胃腺癌中表達(dá)低于正常組織。CTDSPL又稱CTD小磷酸酶，是一種在人類正常組織中表達(dá)的蛋白質(zhì)，其活化與蛋白磷酸酶活性相關(guān)。其作用可能是通過控制轉(zhuǎn)錄物的延伸，從而負(fù)向調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄；如果相應(yīng)蛋白磷酸酶活性被抑制，則CTDSPL活性亦受到抑制，從而影響相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。此外，用CTDSPL轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系MCF-7可導(dǎo)致另一種腫瘤抑制劑磷酸化，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞停滯于G1/S周期[11]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，HMCN1相關(guān)蛋白CTDSPL的表達(dá)在胃腺癌組織中下調(diào)，提示在正常組織中HMCN1基因可能誘導(dǎo)CTDSPL蛋白產(chǎn)生活性，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)，從而發(fā)揮抑癌作用。

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