鄭丹丹， 錢粉紅， 鄧霞， 莊瓊馨， 柳星星

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

惡性胸腔積液是由腫瘤侵襲胸膜后導(dǎo)致人體胸膜腔內(nèi)液體異常增多所致?；颊叱霈F(xiàn)惡性胸腔積液提示腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，屬于腫瘤晚期，預(yù)后往往較差。因此，臨床上對惡性胸腔積液的早期診斷尤為重要。胸腔積液穿刺檢查不僅可緩解患者呼吸困難，還可進(jìn)行胸腔積液的細(xì)胞病理學(xué)檢查以及胸膜活檢，而后兩種病理學(xué)檢查是診斷惡性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，但陽性率偏低[1-2]。胸腔積液腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原雖有較高的特異性，但診斷的敏感性往往欠佳[1]。因此，尋找一種無創(chuàng)、準(zhǔn)確率高、操作方便、費(fèi)用低、并發(fā)癥少的鑒別胸腔積液良惡性的方法是目前臨床上急需解決的難題。

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在多種疾病中，患者的痰液、關(guān)節(jié)液、腦脊液、血液等體液中存在一些種類miRNA的差異表達(dá)[3-7]，這些miRNA有可能成為診斷的特異性標(biāo)志物。本研究擬選用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測惡性胸腔積液和良性胸腔積液中miR-146a、miR-185的相對表達(dá)量，并構(gòu)建受試者工作特征曲線(ROC)，評價這兩種miRNA用于鑒別診斷惡性胸腔積液的臨床效能。

1 對象與方法

1.1 病例和標(biāo)本

收集2016年2月到2017年12月在本院診斷為胸腔積液病例的胸腔積液標(biāo)本共81份。標(biāo)本的納入標(biāo)準(zhǔn)：胸腔積液病因診斷明確，并且為初診初治患者，均未經(jīng)抗結(jié)核治療、化療、放療、分子靶向、生物免疫治療。標(biāo)本中包括惡性胸腔積液40例，均經(jīng)細(xì)胞組織病理學(xué)證實，其中肺腺癌34例，肺鱗癌2例，小細(xì)胞肺癌4例,年齡中位數(shù)為65.00歲；良性胸腔積液41例，其中結(jié)核性胸腔積液24例，類肺炎性胸腔積液12例，漏出性胸腔積液5例，年齡中位數(shù)為56.61歲。良、惡性胸腔積液患者的年齡、性別分布間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。標(biāo)本采集前均告知患者相關(guān)并發(fā)癥風(fēng)險并經(jīng)患者知情同意。

表1 兩組胸腔積液患者的年齡和性別分布 例

1.2 標(biāo)本收集

常規(guī)B超定位胸腔積液后對患者行胸腔穿刺術(shù)，用含有枸櫞酸鈉抗凝劑的50 mL無菌離心管收集200 mL的胸腔積液，充分搖勻后，立即置于4 ℃，1 500 r/min離心20 min。離心后棄上清液，采用紅細(xì)胞裂解液裂解胸腔積液沉淀物中的紅細(xì)胞，吹打混勻后置于4 ℃的離心機(jī)中，500 r/min離心5 min。離心后去上清液，用PBS液沖洗沉積物2次，離心后在沉積物中加Trizol液，吹打混勻后置于-70 ℃的冰箱凍存。同時收集患者胸腔積液中癌胚抗原及CYFRA 21-1的檢測值資料。

1.3 RT-PCR檢測胸腔積液中miR-146a和miR-185的表達(dá)

1.3.1 RNA提取 采用Trizol法(廣州銳博生物有限公司提供試劑)提取胸腔積液沉淀物的總RNA，使用U-2800 紫外分光光度儀測定其濃度及純度，置超低溫冰箱(-70 ℃) 儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 使用日本TaKaRa公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent(RR037A)，由廣州銳博公司提供引物，并按照該公司提供的Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后的操作均在冰上完成：取2μg的總RNA，分別加入2μL miR-185、miR-146a、U6的反轉(zhuǎn)錄引物工作液，加DEPC水至11μL，放置PCR機(jī)70 ℃10 min后冰上孵育2 min；隨后加5×PrimeScript緩沖液7μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL,加DEPC水至25μL體系，放置于PCR機(jī)42 ℃60 min，70 ℃10 min一個循環(huán)后立即取出，冰上孵育2 min，最后置-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RT-PCR 使用日本TaKaRa公司提供的實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix EX TaqTM(RR420A)，由廣州銳博提供引物，并按照銳博公司提供的Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的說明書操作。隨后實驗操作均在冰上完成：取2 μL cDNA，加入9 μL SYBR、0.4 μL ROX，前引物和后引物各0.8 μL，最后加DEPC水至20 μL，置于熒光定量PCR儀Mx3000p 95 ℃ 20 s 1個循環(huán)；95 ℃10 s，60 ℃20 s 40個循環(huán)；95 ℃15 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s 1個循環(huán)。計算機(jī)自動輸出標(biāo)本的擴(kuò)增、熔解曲線、CT值。采用2-△Ct計算胸腔積液中miR-185、miR-146a的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。檢測值均符合非正態(tài)分布，因此選用中位數(shù)表示計量資料。選用Mann-WhitneyU秩和檢驗對兩獨(dú)立樣本行非參數(shù)檢驗。繪制ROC曲線評估m(xù)iR-146a、miR-185對惡性胸腔積液的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 良惡性胸腔積液中miR-146a、miR-185的表達(dá)

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，miRNA-146a、miRNA-185在惡性胸腔積液中的表達(dá)均明顯低于良性胸腔積液(P均<0.01)。臨床資料也顯示良、惡性胸腔積液中的癌胚抗原和CYFRA 21-1濃度間的差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。見表2。

表2 4種標(biāo)志物在胸腔積液中的檢測值 中位數(shù)(范圍)

2.2 miR-146a及miR-185在惡性胸腔積液中的表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性

統(tǒng)計分析顯示，在惡性胸腔積液中miR-146a及miR-185的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、吸煙史、病理分型均無明顯相關(guān)性(P≥0.05)。見表3。

表3 惡性胸腔積液miR-146a及miR-185表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性 中位數(shù)(范圍)

2.3 miR-146a、miR-185與癌胚抗原、CYFRA 21-1在良惡性胸腔積液中診斷價值的比較

ROC曲線顯示，miR-146a和miR-185的曲線下面積(AUC)均低于癌胚抗原，但高于CYFRA21-1。miR-146a診斷的敏感度均高于癌胚抗原及CYFRA 21-1，miR-185診斷的敏感性高于CYFRA 21-1，但低于癌胚抗原，而特異性均低于癌胚抗原和CYFRA 21-1。miR-146a、miR-185聯(lián)合診斷的AUC與單獨(dú)診斷的AUC相比并無明顯提高，取最佳臨界值為1 856，其敏感性低于單獨(dú)診斷，而特異性高于miR-146a，但低于miR-185。聯(lián)合癌胚抗原能進(jìn)一步提高兩類miRNA診斷惡性胸腔積液的AUC。但兩種miRNAs共同聯(lián)合癌胚抗原診斷惡性胸腔積液的AUC較任一種miRNA聯(lián)合癌胚抗原無明顯上升。見圖1、表4。

圖1 胸腔積液中各檢測標(biāo)記物診斷的ROC曲線

表4 各種標(biāo)志物在胸腔積液中的診斷效能評價

3 討論

本研究結(jié)果顯示在良、惡性胸腔積液中miR-146a、miR-185表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。ROC曲線顯示惡性胸腔積液中miR-146a、miR-185的診斷敏感性均高于經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原、CYFRA 21-1，但兩種miRNAs的特異度均低于癌胚抗原、CYFRA 21-1。兩種miRNAs中任一種聯(lián)合癌胚抗原或兩種miRNAs共同聯(lián)合癌胚抗原均能進(jìn)一步提高對惡性胸腔積液的診斷效能。

Xie等[8-9]利用定量RT-PCR技術(shù)于2010年首次發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中miR-24、miR-30d的表達(dá)量較良性胸腔積液上調(diào)。隨后，國內(nèi)外多項研究均顯示miRNAs在良、惡性胸腔積液中存在差異性表達(dá)[10-12]。Shin等[13]發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中miR-185的表達(dá)水平低于良性胸腔積液，并與臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)癌胚抗原與miRNA聯(lián)合應(yīng)用可提高惡性胸腔積液的診斷效能。該研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本實驗還發(fā)現(xiàn)miR-146a、miR-185在惡性胸腔積液中的表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙史及臨床分型無明顯相關(guān)性。因此，miR-146a、miR-185有望成為鑒別診斷惡性胸腔積液的腫瘤標(biāo)志物。

miRNAs的異常表達(dá)可發(fā)生在多種類型的惡性腫瘤中，其可作用于癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wang等[14]研究表明miR-146a在非小細(xì)胞肺癌的組織和細(xì)胞中均表達(dá)較低，充當(dāng)抑癌基因的作用。該研究發(fā)現(xiàn)通過增加miR-146a的表達(dá)可以靶向抑制巨噬細(xì)胞游走抑制因子的表達(dá)水平。實驗表明miR-146a經(jīng)NF-kB信號途徑實現(xiàn)抑制腫瘤的增殖并發(fā)揮了誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。在胃癌、前列腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤中miR-146a顯示出抑癌基因的作用[15-17]。Li等[18]發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中miR-185的表達(dá)顯著下調(diào)，miRNA-185通過靶向AKT1調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及體內(nèi)腫瘤生長。Qiu等[19]的研究表明胃癌中miR-185呈低表達(dá)，其通過調(diào)控靶基因TRIM29參與胃癌的形成與發(fā)展。Zou等[20]的研究表明miR-185在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，Raf-1激酶抑制蛋白通過上調(diào)靶向高遷移率組AT-hook 2的miR-185來抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。綜上，miR-146a、miR-185可通過靶向目的基因參與調(diào)控多種腫瘤的增殖、遷移和侵襲，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但目前惡性胸腔積液的形成機(jī)制尚不明確，miR-146a、miR-185在惡性胸腔積液中低表達(dá)的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

綜上，本研究表明，與良性胸腔積液相比，miR-146a、miR-185在惡性胸腔積液中顯著低表達(dá)。雖然，國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)miRNA在胸腔積液中存在差異性表達(dá)[10-12]，但是對同一種miRNA的研究相對較少，即miRNA的重復(fù)性仍需要后續(xù)研究的驗證。本研究雖然顯示miR-146a、miR-185有望作為鑒別惡性胸腔積液的非侵入性的標(biāo)志物，但是臨床惡性胸腔積液的確診仍需要病理學(xué)證據(jù)。另外，本研究的樣本量偏少也可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生偏移，需要大樣本進(jìn)一步驗證。

[ 1 ] Na MJ. Diagnostic tools of pleural effusion [J]. Tuberc Respir Dis, 2014, 76(5):199-210.

[ 2 ] Dixon G, de Fonseka D, Maskell N.Pleural controversies:image guided biopsy vs. thoracoscopy for undiagnosed pleural effusions?[J]. J Thorac Dis, 2015, 7(6):1041-1051.

[ 3 ] Sheervalilou R, Ansarin K, Fekri Aval S, et al. An update on sputum microRNAs in lung cancer diagnosis[J]. Diagn Cytopathol, 2016, 44(5):442-449.

[ 4 ] Kolhe R, Hunter M, Liu S, et al. Gender-specific differential expression of exosomal miRNA in synovial fluid of patients with osteoarthritis[J]. Sci Rep, 2017, 7(1):2029.

[ 5 ] Müller M, Kuiperij HB, Versleijen AA, et al. Validation of microRNAs in cerebrospinal fluid as biomarkers for different forms of dementia in a multicenter study[J].J Alzheimers Dis,2016, 52(4):1321-1333.

[ 6 ] Pospisilova S, Pazourkova E, Horinek A, et al. MicroRNAs in urine supernatant as potential non-invasive markers for bladder cancer detection[J]. Neoplasma, 2016, 63(5):799-808.

[ 7 ] Huang Y, Hu Q, Deng Z, et al. MicroRNAs in body fluids as biomarkers for non-small cell lung cancer: a systematic review [J]. Technol Cancer Res Treat, 2013, 13(3):277-287.

[ 8 ] Xie L,Wang T, Yu S, et al. Cell-free miR-24 and miR-30d, potential diagnostic biomarkers in malignant effusions[J]. Clin Biochem, 2010, 44(2/3):216-220.

[ 9 ] Xie L, Chen X, Wang L, et al. Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[J]. BMC Cancer, 2010, 10:591.

[10] Han HS, Yun J, Lim SN, et al. Downregulation of cell-free miR-198 as a diagnostic biomarker for lung adenocarcinoma-associated malignant pleural effusion[J].Int J Cancerl,2013,133(3): 645-653.

[11] Cappellesso R,Nicolè L,Caroccia B,et al.Young investigator challenge:MicroRNA-21/MicroRNA-126 profiling as a novel tool for the diagnosis of malignant mesothelioma in pleural effusion cytology[J]. Cancer Cytopathol, 2016, 124(1):28-37.

[12] Qian Q, Sun W, Zhu W, et al. The role of microRNA-93 regulating angiopoietin2 in the formation of malignant pleural effusion[J]. Cancer Med, 2017, 6(5):1036-1048.

[13] Shin YM, Yun J, Lee OJ, et al. Diagnostic value of circulating extracellular miR-134, miR-185, and miR-22 levels in lung adenocarcinoma-associated malignant pleural effusion[J]. Cancer Res Treat, 2014, 46(2):178-185.

[14] Wang WM, Liu JC. Effect and molecular mechanism of

mir-146a on proliferation of lung cancer cells by targeting and regulating MIF gene[J]. Asian Pac J Trop, 2016, 9(8):806-811.

[15] Chen YM, Zhou B, Xu LB, et al. MicroRNA-146a promotes gastric cancer cell apoptosis by targeting transforming growth factor β-activated kinase 1[J]. Mol Med Rep, 2017, 16(1): 755-763.

[16] Huang Y, Tao T, Liu C, et al. Upregulation of miR-146a by YY1 depletion correlates with delayed progression of prostate cancer[J]. Int J Oncol, 2017, 50(2):421-431.

[17] Stückrath I, Rack B, Janni W, et al. Aberrant plasma levels of circulating miR-16, miR-107, miR-130a and miR-146a are associated with lymph node metastasis and receptor status of breast cancer patients[J]. Oncotarget, 2015, 6(15):13387-13401.

[18] Li S, Ma Y, Hou X, et al. MiR-185 acts as a tumor suppressor by targeting AKT1 in non-small cell lung cancer cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(9):11854-11862.

[19] Qiu F, Xiong JP, Deng J, et al. TRIM29 functions as an oncogene in gastric cancer and is regulated by miR-185[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(5):5053-5061.

[20] Zou Q, Wu H, Fu F, et al. RKIP suppresses the proliferation and metastasis of breast cancer cell lines through up-regulation of miR-185 targeting HMGA2[J]. Arch Biochem Biophys, 2016, 610:25-32.