劉銳， 種曉丹， 趙昕， 陸仁飛， 孫嘉遙， 黃新祥

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院腫瘤研究所， 上海 200433)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，S. Typhi)主要通過污染的食物和水傳播[1]。S.Typhi進入機體后，通過胃、十二指腸，最終侵入小腸的腸黏膜[2-3]。最近幾年，在細(xì)菌中鑒定出大量的非編碼RNA，其對細(xì)菌的表型起著重要的調(diào)節(jié)作用，比如動力、生物膜形成和毒力等。我們前期對傷寒沙門菌進行高通量測序和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了許多非編碼RNA，如flhDC基因?qū)?cè)編碼的疑似非編碼RNA，并將其命名為AsfD(未發(fā)表)。在本研究中，我們先后通過RNA印跡，RT-PCR和cDNA 5′末端快速擴增實驗(5′rapid amplification of cDNA ends，5′RACE)鑒定AsfD的長度，最后通過qRT-PCR檢測AsfD在不同生長時相和環(huán)境應(yīng)激條件下的表達(dá)量變化。

1 材料與方法

1.1 材料

S.Typhi野生株GIFU 10007由本實驗室保存。NaCl、NaOH、HCl、無水乙醇、異丙醇均購于上海國藥公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 Marker、rTaqDNA聚合酶、5′RACE試劑盒(大連TaKaRa公司)；DIC Northern試劑盒(Roche公司)；質(zhì)粒提取試劑盒購于上海生工公司；RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)。

PCR儀(ABI公司)；熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)；核酸紫外檢測儀(Thermo公司)；核酸雜交儀(Roller-Blot公司)。

1.2 引物

根據(jù)S．Typhi全基因組序列，設(shè)計特異性引物序列送蘇州泓迅進行合成，引物序列及用途詳見表1。

表1 引物名稱及序列

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

過夜培養(yǎng)S. Typhi野生株，次日以1 ∶100的比例接種到LB培養(yǎng)液中，于37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)，每培養(yǎng)一段時間檢測細(xì)菌時相，直至生長到需要的時相，D(600nm)值分別為0.4、1.0、2.0。為模擬細(xì)菌環(huán)境應(yīng)激，在D(600 nm)=0.4的菌液中分別加酸(HCl，pH=4.5)，氧(H2O2， 4 mmol/L)和鹽(NaCl，0.3mol/L)，應(yīng)激30 min。收集培養(yǎng)液中的細(xì)菌，用Trizol法提取細(xì)菌總RNA，用DNA酶Ⅰ去除殘留DNA，通過核酸紫外檢測儀檢測RNA濃度。

1.4 RNA印跡檢測AsfD表達(dá)

在已知AsfD序列區(qū)設(shè)計特異性引物(表1)，以S.Typhi染色體為模板，進行PCR擴增獲得探針模板。用QIA快速PCR純化試劑盒(QIAGEN公司)純化PCR產(chǎn)物，體外轉(zhuǎn)錄制備RNA探針。取RNA樣品10 μg電泳4 h(200 V)，轉(zhuǎn)膜，56 ℃雜交12 h，洗膜并加地高辛抗體，曝光顯影。

1.5 RT-PCR尋找AsfD轉(zhuǎn)錄起始和終止區(qū)域

尋找AsfD轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域：在AsfD已知序列區(qū)設(shè)計1條逆向引物5′PB，已知序列區(qū)上游不同區(qū)域設(shè)計7條前向引物5′PA1～7，以S.Typhi野生株基因組DNA為模板和各種特異性引物進行PCR擴增的片段(377、554、777、976、1185、140、1 603 bp)作為陽性對照，以RNA樣本和各種特異性引物進行RT-PCR擴增。

尋找AsfD轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域：在AsfD已知序列區(qū)設(shè)計1條前向引物3′PA，已知序列區(qū)下游不同區(qū)域設(shè)計4條逆向引物3′PB1～4，以S.Typhi野生株基因組DNA為模板和各種特異性引物進行PCR擴增的片段(424、657、853、1 044 bp)作為陽性對照，以RNA樣本和各種特異性引物進行RT-PCR擴增。

1.6 5′RACE

采用SMARTer RACE 5′/3′試劑盒進行AsfD 5′RACE。在AsfD近5′端1 216～1 443 bp設(shè)計特異性逆向引物5′R-GSP，取對數(shù)生長期的細(xì)菌總RNA 1 μg進行反轉(zhuǎn)錄，按說明書操作在cDNA5′端加SMARTer Ⅱ A寡核苷酸接頭，UPM(前向隨機引物)和5′R-GSP進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物克隆到PUC19載體。最后選出疑似陽性菌的質(zhì)粒送泓迅進行DNA測序，檢測AsfD的轉(zhuǎn)錄起始位點。

1.7 qRT-PCR檢測AsfD的表達(dá)

取不同生長時相和環(huán)境應(yīng)激條件下的細(xì)菌，提取總RNA各4 μg；用特異性逆向引物AsfD qR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以AsfD qF/qR進行qRT-PCR，以5S rRNA作為內(nèi)參，用5S-R引物進行反轉(zhuǎn)錄，用5S-F/R進行qRT-PCR。實驗分3批，每批重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

運用GraphPad進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用Student′st檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA印跡鑒定AsfD在傷寒沙門菌中的表達(dá)

結(jié)果如圖1所示，電泳可見長為2 300 nt左右的特異性條帶，說明傷寒沙門菌中確有AsfD表達(dá)，長約2 300 nt。

M: RNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：RNA樣本與特異性探針雜交條帶

2.2 RT-PCR分析AsfD的轉(zhuǎn)錄起始和終止位區(qū)域

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，片段長度分別為377、554、777、976和1 185 bp有陽性擴增，但長度為1 401 bp及1 603 bp的擴增為陰性。結(jié)合傷寒沙門菌基因組結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明AsfD轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域位于flhC基因終止密碼子下游434～660 bp之間。見圖2。

結(jié)果如圖3所示，片段長度分別為424 bp、657 bp、853 bp有陽性擴增，但長為1 044 bp的擴增為陰性。結(jié)合傷寒沙門菌基因組結(jié)構(gòu)分析，表明AsfD轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域位于flhD基因起始密碼子上游558～788 bp之間。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1、4、7、10、13、16、19：樣本PCR產(chǎn)物；2、5、8、11、14、17、20：未加入反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對照；3、6、9、12、15、18、21：陽性對照

圖2RT-PCR分析AsfD的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域

M: DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1、4、7、10：樣本PCR產(chǎn)物；2、5、8、11：未加入反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對照；3、6、9、12：陽性對照

圖3RT-PCR分析AsfD的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域

2.3 5′RACE確定AsfD的轉(zhuǎn)錄起始位點

結(jié)果如圖4所示，電泳中出現(xiàn)疑似陽性質(zhì)粒條帶；將疑似陽性質(zhì)粒送泓迅進行DNA測序。結(jié)果顯示AsfD轉(zhuǎn)錄起始位點位于flhC基因終止密碼子下游590 nt處(圖5)。并且序列分析整個AsfD片段沒有發(fā)現(xiàn)明顯的ORF序列。

2.4 傷寒沙門菌AsfD的表達(dá)特性分析

qRT-PCR結(jié)果表明，AsfD在傷寒沙門菌生長的穩(wěn)態(tài)期表達(dá)較高，而在HCl，H2O2，NaCl應(yīng)激后表達(dá)均明顯下降。見圖6。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：疑似陽性質(zhì)粒；2：陰性對照

圖45′RACE質(zhì)粒電泳分析結(jié)果

+1：AsfD轉(zhuǎn)錄起始位點；方框內(nèi)為flhC終止碼

圖6 不同時相和應(yīng)激條件下AsfD的表達(dá)量

3 討論

長鏈非編碼RNA是指長度超過200 nt的非編碼RNA，因缺少ORF系列而不能編碼蛋白質(zhì)[4-5]。本研究組前期通過RNAseq分析，發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌flhDC基因反義鏈編碼一個疑似非編碼RNA AsfD，其長度接近2 000 nt(未發(fā)表)；為了進一步鑒定AsfD分子特性，進行RNA印跡，RT-PCR和5′RACE等實驗，結(jié)果表明AsfD的長度在2 079 nt～2 310 nt之間，AsfD確定的2 079 nt序列能夠完全覆蓋flhDC基因;序列分析整個AsfD片段沒有發(fā)現(xiàn)明顯的ORF序列。以上結(jié)果表明新發(fā)現(xiàn)的疑似非編碼RNA AsfD很可能為傷寒沙門菌中新的長鏈非編碼RNA。

我們通過qRT-PCR分別檢測S.Typhi在不同生長階段和應(yīng)激條件下AsfD的表達(dá)水平。結(jié)果表明，AsfD的轉(zhuǎn)錄水平隨著S.Typhi生長而增加，并且在穩(wěn)態(tài)期達(dá)到最高，這與之前的一些非編碼RNA在穩(wěn)態(tài)期能夠高表達(dá)的研究結(jié)果相一致[6]。同時還發(fā)現(xiàn)，傷寒沙門菌AsfD的轉(zhuǎn)錄水平在酸、氧和高滲環(huán)境應(yīng)激下均下降，說明其可能為細(xì)菌中的一個調(diào)節(jié)性長非編碼RNA。

flhDC基因是由flhD和flhC基因構(gòu)成的操縱子，能夠編碼鞭毛的主要調(diào)控因子FlhDC[7]。之前的研究表明，一些非編碼RNA能夠調(diào)控flhDC操縱子的表達(dá)以及動力：例如，sRNA ArcZ、OmrA和OmrB能夠通過與flhDC操縱子mRNA 5′端堿基配對從而調(diào)控動力和flhDC的表達(dá)[8]，McaS能夠增強鞭毛合成的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子FlhD表達(dá)，從而增強細(xì)菌動力[9]。由于本研究鑒定的AsfD能夠完全覆蓋flhDC操縱子。因此，我們猜測AsfD很可能影響flhDCmRNA的穩(wěn)定性而調(diào)控其表達(dá)水平，從而影響細(xì)菌的動力。

綜上所述，本研究針對在RNAseq分析基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)的一個新的疑似非編碼RNA AsfD，通過分子鑒定分析，確定為長鏈非編碼RNA，且其長度在2 079～2 310 nt之間。AsfD的轉(zhuǎn)錄水平隨著生長而增加，在穩(wěn)態(tài)期達(dá)最高，而在酸、氧和高滲環(huán)境應(yīng)激下均下降；關(guān)于其具體功能作用機制尚有待進一步研究。

[ 1 ] Chiou CS, Lauderdale TL, Phung DC, et al. Antimicrobial resistance inSalmonellaentericaSerovar Typhi isolates from Bangladesh, Indonesia,Taiwan,and Vietnam[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014,58(11): 6501-6507.

[ 2 ] Ahirwar SK, Pratap CB,Patel SK,et al.Acid exposure induces multiplication ofSalmonellaentericaserovar Typhi[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52(12): 4330-4333.

[ 3 ] Kaur J, Jain SK. Role of antigens and virulence factors ofSalmonellaentericaserovar Typhi in its pathogenesis[J]. Microbiol Res, 2012, 167(4): 199-210.

[ 4 ] Wang Y, Xu G, Chen W, et al. Detection of long-chain non-encoding RNA differential expression in non-small cell lung cancer by microarray analysis and preliminary verification[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(3): 1925-1932.

[ 5 ] He K, Wang P. Unregulated long non-coding RNA-AK058003 promotes the proliferation, invasion and metastasis of breast cancer by regulating the expression levels of the gamma-synuclein gene[J]. Exp Ther Med, 2015, 9(5): 1727-1732.

[ 6 ] Vogel J, Bartels V,Tang TH,et al.RNomics inEscherichiacolidetects new sRNA species and indicates parallel transcriptional output in bacteria[J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(22): 6435-6443.

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[ 8 ] De Lay N,Gottesman S.A complex network of small non-coding RNAs regulate motility inEscherichiacoli[J]. Mol Microbiol, 2012, 86(3): 524-538.

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