路慶艷， 劉寶翠， 毛朝明， 董昕， 牟笑， 許鋮鋮， 鄭婷婷

(江蘇大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis， HT)是造成甲狀腺功能減退癥最常見的原因，其主要病理機制是大量淋巴細胞浸潤甲狀腺間質并免疫損傷甲狀腺細胞[1]。小窩蛋白-1(Caveolin-1)是細胞膜上囊狀樣結構小窩的主要蛋白，在正常甲狀腺上皮細胞中，主要位于細胞膜的頂端，維持甲狀腺激素的正常合成。先前的研究發(fā)現(xiàn)，橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織中Caveolin-1的表達降低，尤其在淋巴浸潤嚴重的區(qū)域更為顯著[2-3]。近年來研究顯示，趨化因子在誘導橋本甲狀腺炎患者淋巴細胞浸潤的過程中發(fā)揮重要的介導作用[4-6]。本研究旨在構建Caveolin-1基因RNA干擾慢病毒，探討其對人甲狀腺上皮細胞Nthy-ori 3趨化因子mRNA表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺上皮細胞系Nthy-ori 3-1購自ECACC細胞中心, 人胚腎上皮細胞293T、shRNA慢病毒載體pLKO.1、包膜質粒pMD2.G、包裝質粒psPAX2均由上海中科院提供。兔抗人β-肌動蛋白抗體、兔抗人Caveolin-1抗體(CST公司)；細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；脫脂奶粉(恒天然有限公司)；RNA抽取試劑Trizol、逆轉錄試劑(日本TaKaRa公司); 2×含染料Taq預混PCR反應試劑 (北京康潤誠業(yè)生物公司)；氨芐青霉素、嘌呤霉素，感受態(tài)大腸埃希菌DH5α、質粒小抽試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；ECL發(fā)光液、全蛋白提取試劑盒、PVDF膜(美國Millipore公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Nthy-ori 3-1細胞和293T細胞分別在含有10% 胎牛血清的RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 重組質粒pLKO.1-Caveolin-1的構建 Caveolin-1特異性正、反義鏈shRNA(shCaveolin-1)序列由蘇州吉瑪基因有限公司設計并合成，正義鏈：5′-CCGGCCTTCACTGTGACGAAATACTCTCGAGAG-TATTTCGTCACAGTGAAGGTTTTTG-3′, 反義鏈：5′-AATTCAAAAACCTTCACTGTGACGAAATACTCTCG-AGAGTATTTCGTCACAGTGAAGG-3′。將單鏈引物序列退火成雙鏈Oligo干擾片段，與線性化的pLKO.1-嘌呤霉素的空載連接。將重組質粒轉入感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，涂布于含有氨芐抗性的LB瓊脂平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取數個單克隆，進行基因測序，提取重組質粒，以備轉染293T細胞。

1.2.3 慢病毒包裝及感染 293T細胞密度為70%時，將空載pLKO.1或目的基因質粒Caveolin-1 shRNA與慢病毒包膜質粒pMD2.G、包裝質粒psPAX2共轉染293T細胞。48 h后，收集病毒液并感染Nthy-ori 3-1細胞。嘌呤霉素篩選出陽性細胞，分別命名為shMock組細胞(空載質粒病毒感染)和shCaveolin-1組細胞(目的基因質粒病毒感染)。倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，熒光實時定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質印跡檢測病毒的感染效果。

1.2.4 qRT-PCR檢測兩組Nthy-ori 3-1細胞Caveolin-1和趨化因子的mRNA表達 細胞處于對數生長期時，用Trizol法提取總RNA。在37 ℃ 1 h、85 ℃ 15 s、4 ℃保存反應條件下，將1 μg RNA反轉錄為cDNA。qRT-PCR引物由上海生工有限公司合成，各引物序列如下：GAPDH上游5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游5′- GGGTGGAATCATATTGGAACA -3′；Caveolin-1上游5′-TCAACCGCGACCCTAAACACC-3′，下游5′-TGAAATAGC TCAGAAGAGACA-3′；CXC趨化因子配體10(CXCL10)上游: 5′-CCACGTGTTGAGATCATTGC-3′,下游5′-CCTCTGTGTGGTCCATCCTT-3′；CC趨化因子配體20(CCL20)上游 5′-GTGGCTTTTCTGGAATGGAA-3′，下游 5′-GACAAGTCCAGTGAGGCACA-3′。PCR反應體系10 μL：2×含染料Taq預混PCR反應試劑5 μL，引物1 μL(終濃度為2 μmol/L)，cDNA 4 μL。正常兩步法：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，進行40次循環(huán)。以GAPDH為內參，所得結果用2-ΔΔCt方法進行分析，實驗獨立重復3次。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測Caveolin-1的表達 收集經0.25%胰酶消化后的兩組Nthy-ori 3-1細胞，250×g離心5 min，PBS重復洗滌2次。加入預冷的裂解液，冰上放置30 min，12 000×g離心3 min，BCA法測定蛋白濃度。經100 ℃ 10 min變性后，取5 μg蛋白樣本進行SDS-PAGE分離，并濕轉至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入兔抗人Caveolin-1抗體(1 ∶1 000)，兔抗人β-肌動蛋白抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)，37 ℃孵育1h，PBST洗滌3次，ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Nthy-ori 3-1感染慢病毒后的細胞形態(tài)

測序正確后，用包裝好的慢病毒感染Nthy-ori 3-1細胞，嘌呤霉素連續(xù)篩選3天后，普通倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)shMock組和shCaveolin-1組細胞與正常甲狀腺上皮細胞相比，其形態(tài)變圓，生長速度減慢，但細胞狀態(tài)良好，可以正常傳代(圖1)。

2.2 shCaveolin-1慢病毒干擾效果的驗證

qRT-PCR檢測結果顯示，與shMock組相比，shCaveolin-1組中Caveolin-1的mRNA水平明顯下調(t=19.55 ,P<0.01；圖2)。蛋白質印跡結果顯示， shCaveolin-1組中Caveolin-1的蛋白表達低于shMock組(圖3)。表明穩(wěn)定敲除Caveolin-1的甲狀腺上皮細胞構建成功。

圖1 倒置顯微鏡觀察甲狀腺上皮細胞形態(tài)(×20)

圖2 qRT-PCR檢測Nthy-ori 3-1細胞Caveolin-1的mRNA相對表達量

圖3 蛋白質印跡檢測Nthy-ori 3-1細胞Caveolin-1的蛋白水平

2.3 敲減Caveolin-1后Nthy-ori 3-1細胞趨化因子mRNA表達升高

qRT-PCR結果顯示，穩(wěn)定敲減Caveolin-1的Nthy-ori 3-1細胞CXCL10和CCL20的mRNA表達水平顯著升高(P均<0.05，圖4)。

3 討論

橋本甲狀腺炎和Graves病是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病，以血清中產生高滴度抗促甲狀腺激素受體抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺過氧化物酶抗體等自身抗體為特征[7-8]。研究認為，在易感基因及環(huán)境等因素作用下, 自身免疫耐受遭受破壞, 誘發(fā)大量淋巴細胞浸潤，導致甲狀腺功能紊亂，是橋本甲狀腺炎發(fā)病的主要原因[5, 9-12], 但其具體發(fā)病機制仍不清楚。

圖4 qRT-PCR檢測Nthy-ori 3-1細胞CXCL10和CCL20的mRNA水平

趨化因子是一種通過與相應受體結合，吸引中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞到炎癥部位，參與炎癥反應的低分子量分泌性蛋白。正常情況下，主要是由淋巴細胞產生，然而在一些促炎因子的作用下，甲狀腺上皮細胞也能分泌多種趨化因子[6]。 研究發(fā)現(xiàn)，橋本甲狀腺炎患者外周血中CXCL10和CCL20水平顯著增高[13-15]。CXCL10主要在疾病的初始階段招募已活化的T淋巴細胞，啟動炎癥反應[16]，CCL20可能參與趨化Th17細胞遷移、聚集至病變組織，加重炎癥損傷[17-18]。

最近研究報道，Caveolin-1通過自身的腳手架區(qū)域(scaffolding domain，CSD)調控一些趨化因子的表達[19-20]。Yamaguchi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，人角質形成細胞中Caveolin-1表達減少，導致趨化因子CXCL8、CXCL9及CCL20分泌增加，加重皮膚炎癥反應。Tiwari等[20]研究顯示，給予吸煙誘導的肺損傷小鼠腹腔注射CSD肽，能夠顯著抑制肺泡上皮細胞中CXCL1和CXCL2的分泌，緩解肺損傷。最近研究表明，橋本甲狀腺炎患者組織中Caveolin-1 的表達降低[3-4]。我們的研究結果顯示，甲狀腺上皮細胞中Caveolin-1的表達減少，能夠顯著上調趨化因子CXCL10和CCL20的mRNA水平，初步提示Caveolin-1可能通過影響某些趨化因子的表達，進而參與橋本甲狀腺炎的病理過程。

在后續(xù)的實驗中，我們將進一步研究Caveolin-1敲減的甲狀腺上皮細胞中其他相關趨化因子的表達及分泌情況，探討甲狀腺上皮細胞相關功能的改變，為橋本甲狀腺炎的免疫病理機制提供新的思路。

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