殷佩， 王穎， 沈振亞

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟大血管外科， 江蘇 蘇州 215006)

目前我國(guó)胸主動(dòng)脈瘤與夾層的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，且患者多以急性發(fā)病住院，死亡率極高。該病發(fā)病是一個(gè)多因素過程，主要病理特征是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、中層平滑肌細(xì)胞壞死、細(xì)胞外基質(zhì)降解、纖維化、彈力纖維變脆等[1]。血管重構(gòu)是管壁成分在血管活性物質(zhì)和血流剪切力變化的刺激下,為適應(yīng)和修復(fù)損傷發(fā)生的改變，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、平滑肌細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移等過程,其在胸主動(dòng)脈瘤/夾層的疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了重要作用。目前對(duì)主動(dòng)脈瘤/夾層發(fā)生的調(diào)控機(jī)制及其預(yù)后影響因素仍不清楚，部分研究提示胸主動(dòng)脈瘤與TGF-β信號(hào)通路的活化具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)[2]。因此研究其關(guān)鍵分子SMAD4對(duì)平滑肌細(xì)胞遷移和凋亡的影響，可深入揭示以血管功能與結(jié)構(gòu)病理改變?yōu)榛A(chǔ)的疾病機(jī)制，可為精準(zhǔn)臨床路徑的制定提供參考。

SMAD4是TGF-β信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的關(guān)鍵組分。許多研究顯示，TGF-β是具有多重生理作用的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與主動(dòng)脈瘤等很多疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[3-5]。而SMAD4的表達(dá)抑制與TGF-β信號(hào)系統(tǒng)的活化相關(guān)，有報(bào)道表明SMAD4敲除的小鼠主動(dòng)脈瘤發(fā)病率遠(yuǎn)高于對(duì)照組[6]。本實(shí)驗(yàn)以SMAD4為切入點(diǎn)，觀察TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)變化對(duì)體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)遷移及凋亡的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HASMC為蘇州大學(xué)心血管病研究所實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及不含EDTA的0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，Hoechest33258染色液(碧云天生物技術(shù)公司)，siRNA-SMAD4、陰性對(duì)照siRNA(si-RNA-NC,GenePharma公司合成)，青霉素(100 U/mL)-鏈霉素(100 mg/mL)為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品。高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，相差顯微鏡(日本Nikon公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，流式細(xì)胞儀及其分析系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 HASMC培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HASMC接種于3個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用于轉(zhuǎn)染，細(xì)胞培養(yǎng)基中不加抗生素。細(xì)胞接種后分3組：siRNA-SMAD4組、siRNA-NC組(陰性對(duì)照)和空白組?？瞻捉M的HASMC不作任何處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后更換含有10%FBS及青-鏈霉素的完全培養(yǎng)基。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HASMC凋亡率

在上述各組HASMC細(xì)胞中加入血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡處理，終濃度為10-6mol/L。24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集后，于室溫下以2 000 r/min離心5 min，用預(yù)冷PBS(4 ℃)洗滌各組細(xì)胞，加入300 μL稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后避光，室溫孵育15 min，加400 μL的PBS，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。以上各組均為3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果為3個(gè)復(fù)孔的均值。

1.4 Transwell檢測(cè)HASMC的遷移能力

在Transwell小室的8 μm聚碳酸酯膜上加入200 μL含有2%FBS的DMEM，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，使膜層水化，吸棄培養(yǎng)基，將制備的細(xì)胞懸液(1.5×104個(gè)細(xì)胞/mL)以200 μL/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h。消化各組細(xì)胞后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并使用DMEM進(jìn)行重懸。每孔上室加入200 μL單細(xì)胞混懸液(1.5×104個(gè)細(xì)胞/mL)，加入AngⅡ至終濃度為10-6mol/L；下室加入500 μL含有10%FBS的DMEM。放入37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。8 h后用棉簽拭去小室上層膜上未遷移的細(xì)胞，膜下方的細(xì)胞即為遷移細(xì)胞，用Hoechest33258染色10 min，并于倒置熒光顯微鏡下拍照，Image J軟件分析遷移細(xì)胞數(shù)。鏡下隨機(jī)選10個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡因子的表達(dá)

將10×的RIPA溶液稀釋成1×，加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使其終濃度為1 mmol/L，收集細(xì)胞，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌去除血清等，去除PBS；加入100 μL裂解液，冰上裂解10 min后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管(離心管提前預(yù)冷)，超聲10 s，12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液即為提取的蛋白樣品。利用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白濃度調(diào)平，加入1/3體積4×上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗分別為Cleaved Caspase-3及Bcl-2(1 ∶1 000)，二抗分別為山羊抗小鼠和山羊抗兔抗體(1 ∶5 000)。洗滌3次后，在PVDF膜上滴加ECL顯影劑，然后放入ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 SMAD4低表達(dá)促進(jìn)HASMCs凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照siRNA-NC組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-SMAD4后HASMC早期細(xì)胞凋亡比例和晚期細(xì)胞凋亡比例均明顯升高(P均<0.05)。見圖1。上述結(jié)果說明SMAD4低表達(dá)可明顯促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡。

n=3

2.2 SMAD4低表達(dá)增強(qiáng)HASMC遷移能力

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組平均每視野遷移細(xì)胞數(shù)為19±6，siRNA-NC組平均為25±7，siRNA-SMAD4組平均為114±21。與空白組和siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-SMAD4后HASMC遷移細(xì)胞數(shù)顯著增多(P均<0.01)。見圖2。該結(jié)果說明SMAD4低表達(dá)能顯著促進(jìn)HASMC的遷移。

2.3 SMAD4低表達(dá)引起凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，SMAD4基因低表達(dá)可明顯下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，顯著上調(diào)Cleaved Caspase-3的表達(dá)(P均<0.05)。見圖3。

圖2 Transwell檢測(cè)各組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移數(shù)

圖3 各組Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)量

3 討論

胸主動(dòng)脈瘤及夾層是一類致死率極高的復(fù)雜疾病，發(fā)病率為(5～30)/10萬[7]。大血管受到諸如血管活性物質(zhì)、血壓和血流剪切力變化刺激，易發(fā)生血管重構(gòu)，即血管為適應(yīng)和修復(fù)損傷,血管壁成分發(fā)生改變，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、平滑肌細(xì)胞凋亡、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移等過程[8-9]。TGF-β信號(hào)系統(tǒng)激活可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控，從而引起增生性細(xì)胞疾病的發(fā)生[10]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)變化對(duì)體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移及凋亡的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路中的核心組分SMAD表達(dá)下調(diào)后，該通路信號(hào)被異?；罨?，HASMC的抗血管緊張素刺激能力顯著下降，細(xì)胞易發(fā)生凋亡；而當(dāng)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)受阻抑之后，HASMC遷移能力增強(qiáng)。TGF-β信號(hào)通路過表達(dá)可引起牛腎小球毛細(xì)血管細(xì)胞、視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等不同類型細(xì)胞的凋亡[11]。Lu等[12]研究證實(shí)TGF-β可引起肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，這種作用是依賴于ALK5-SMAD通路的激活和抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)的下調(diào)。在人和大鼠肝臟上皮細(xì)胞系中，TGF-β通過線粒體激活Caspase-3,導(dǎo)致促進(jìn)凋亡的蛋白Bad裂解為有活性的蛋白片段[13]。相關(guān)研究表明，完整的TGF-β/SMAD通路的作用可能與促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成[12]、維持主動(dòng)脈壁的穩(wěn)態(tài)[14]以及維持HASMC的正常功能有關(guān)。TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻和TGF-β信號(hào)高表達(dá)兩者在致病過程中存在因果關(guān)系和協(xié)同作用，兩者的協(xié)同作用使血管壁結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性遭到破壞，由此可能引發(fā)主動(dòng)脈瘤的形成。

綜上所述，TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子SMAD4表達(dá)下調(diào)可顯著促進(jìn)HASMC遷移和凋亡，并可促進(jìn)Caspase-3降解。本研究有助于揭示以血管功能與結(jié)構(gòu)病理改變?yōu)榛A(chǔ)的胸主動(dòng)脈瘤或夾層的發(fā)病機(jī)制。

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