丁方方， 申紅星， 王華， 邵世和

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心， 安徽 合肥 230032)

胃癌死亡率居世界癌癥第3位[1-2]。由于缺乏特定的早期癥狀，大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)常已屬晚期，5年生存率低于20%[3]。盡管胃癌在手術(shù)、化療、放療和靶向治療等方面取得了顯著進(jìn)展，但是患者預(yù)后仍未得到顯著改善[4]。普列克底物蛋白同源樣結(jié)構(gòu)域家族A成員1蛋白(pleckstrin homology-like domain family A member 1, PHLDA1)是潛在的轉(zhuǎn)錄因子，為Fas(CD95)表達(dá)、活化和誘導(dǎo)小鼠T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞的凋亡所需，編碼一類進(jìn)化高度保守的pleckstrin同源性相關(guān)蛋白家族[5-7]。PHLDA1在多種腫瘤中呈異常表達(dá)[7]：例如，在黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]、口腔癌[10]及胃腺癌[11]中呈低表達(dá)，而在結(jié)腸癌和腸腺癌中呈高表達(dá)，并且結(jié)腸癌細(xì)胞中，PHLDA1敲低可抑制非貼壁依賴性細(xì)胞的生長(zhǎng)且減少其遷移[12-13]。研究表明，PHLDA1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和增殖[14]。關(guān)于PHLDA1在胃癌中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚，本研究通過PHLDA1基因干擾技術(shù)觀察PHLDA1敲減對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，旨在探討PHLDA1在胃癌發(fā)病機(jī)制中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Trizol購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；qRT-PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)胞蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒以及CCK8試劑均購自碧云天生物科技有限公司；靶向敲減PHLDA1基因的siRNA和對(duì)照亂序RNA序列均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；PVDF膜(0.45 μm)購買自密理博(中國(guó))有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz公司)；GAPDH一抗(CST公司)；PHLDA1抗體(Abcam公司)；其他抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司；qRT-PCR引物合成于上海桑尼生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞系MGC-803、BGC-823、MKN- 45、SGC-7901和HGC-27均由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)凍存，均培養(yǎng)于含10%胎牛血清和青、鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、100%濕度、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)。

1.3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)PHLDA1蛋白的表達(dá)

收集“1.2”中5種細(xì)胞沉淀，用含PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，4 ℃，13 500 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)量蛋白濃度；10%SDS-PAGE分離等量的總蛋白(300 ng)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜；洗膜；HRP標(biāo)記羊抗兔抗體室溫下孵育1 h；洗膜；使用ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)特異性條帶。采用Image J(https:∥imagej.nih.gov/ij/)軟件對(duì)譜帶的相對(duì)密度進(jìn)行量化。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。其中，抗體GAPDH作為內(nèi)參。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)各胃癌細(xì)胞中PHLDA1 mRNA水平

根據(jù)說明書，用Trizol提取MGC-803、BGC-823、MKN-45、SGC-7901以及HGC-27各細(xì)胞株的總RNA。分別取各細(xì)胞總RNA 500 ng，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

以各胃癌細(xì)胞系反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，按照說明書進(jìn)行操作，利用ABI Step One Plus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，80～85 ℃收集熒光，40個(gè)循環(huán)；65～95 ℃生成熔解曲線，Roto-Gene Melt Curve Analysis軟件進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)樣品檢測(cè)重復(fù)3次，求得平均Ct值。以GAPDH內(nèi)參基因作空白對(duì)照，按照2-ΔΔCt公式計(jì)算出mRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔΔCt=(Ct實(shí)驗(yàn)組-Ct對(duì)照組)mRNA-(Ct實(shí)驗(yàn)組-Ct對(duì)照組)GAPDH。所用的引物序列如下，GAPDH：上游5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，下游5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′；PHLDA1：上游5′-CTCCAACATGAAGACCGTG-3′，下游5′-GCCTGACGATTCTTGTACT-3′。

1.5 MGC-803細(xì)胞的轉(zhuǎn)染分組及凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)

制備MGC-803細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約1.0×105個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔2 mL；培養(yǎng)細(xì)胞18～24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到約60%時(shí)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染；將細(xì)胞分為2組，對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染亂序RNA(siR-NC)，干擾組細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向干擾的PHLDA1 siRNA(siR-PHLDA1)。siRNA序列如下：siR-NC正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′； siR-PHLDA正義鏈5′-AAGAAUGUGCCAAGUGUAAGA-3′，反義鏈5′-UCUUACACUUGGCACAUUCUU-3′。

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)2組細(xì)胞PHLDA1和Bax、Caspase-8、Cleaved-caspase-8、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Caspase-9和Cleaved-caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，具體方法同“1.3”；其中，抗體GAPDH作為內(nèi)參，抗體稀釋比均為1 ∶1 000。

1.6 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGC-803細(xì)胞的增殖能力

轉(zhuǎn)染后48 h，消化細(xì)胞，接種于含無血清培養(yǎng)基的96孔板中(5×103/孔)，分別設(shè)置對(duì)照組和干擾組，共5對(duì)，每對(duì)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞混勻后于孵育箱培養(yǎng)4～6 h；待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基替換成含血清的培養(yǎng)基；取1對(duì)對(duì)照組和干擾組細(xì)胞，加入預(yù)先混勻的培養(yǎng)基和CCK8試劑混合液(CCK8試劑10 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h；用酶標(biāo)儀讀取細(xì)胞的光密度值，連續(xù)監(jiān)測(cè)5 d；最終以第1次數(shù)值為基線繪制細(xì)胞的增殖曲線。

1.7 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力

取轉(zhuǎn)染48 h后的胃癌細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，接種于含完全培養(yǎng)基的6孔板中(800個(gè)/孔)，分別設(shè)置對(duì)照組和干擾組，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞混勻后繼續(xù)培養(yǎng)7～14 d，每隔3 d更換1次培養(yǎng)基；待細(xì)胞形成明顯的肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，4%低聚甲醛室溫固定20 min；結(jié)晶紫室溫染色30 min；PBS沖洗，室溫晾干，計(jì)數(shù)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各胃癌細(xì)胞株中PHLDA1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

結(jié)果顯示，MGC-803和MKN-45細(xì)胞株中PHLDA1 mRNA表達(dá)量明顯高于其他胃癌細(xì)胞株；MGC-803胃癌細(xì)胞中PHLDA1蛋白表達(dá)量明顯高于其他細(xì)胞株。見圖1。因此，本研究選取MGC-803細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 各胃癌細(xì)胞系中PHLDA1蛋白和mRNA的表達(dá)水平

2.2 PHLDA1 siRNA轉(zhuǎn)染后干擾效率的驗(yàn)證

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與siR-NC組相比，siR-PHLDA1組中PHLDA1表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，見圖2。由此證實(shí)，靶向siRNA PHLDA1轉(zhuǎn)染成功。

2.3 轉(zhuǎn)染PHLDA1 siRNA抑制細(xì)胞增殖

CCK8結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)至第2天時(shí)，siR-PHLDA1組MGC-803細(xì)胞增殖速率較對(duì)照組明顯減慢(t=2.784,P<0.05)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與siR-NC組相比，siR-PHLDA1組細(xì)胞增殖形成的克隆數(shù)量明顯減少，且單個(gè)細(xì)胞形成的克隆直徑明顯減小(t=0.008,P<0.05)。見圖3。

2.4 PHLDA1干擾后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾組MGC-803細(xì)胞中Cleaved-caspase-8，Cleaved-caspase-3，Caspase-9,Cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05或<0.01)，Bax，Caspase-8和Caspase-3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)MGC-803細(xì)胞中PHLDA1蛋白的表達(dá)

a:P<0.05,與siR-NC組比較；A：CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖速度；B：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的克隆形成

a: P<0.05，b：P<0.01；1：Bax；2：Caspase-8；3：Cleaved-caspase-8；4：Caspase-9；5：Cleaved-caspase-9；6：Caspase-3；7：Cleaved-caspase-3

3 討論

研究表明，PHLDA1可能作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)控細(xì)胞的凋亡、增殖、分化和遷移，從而影響細(xì)胞存活和各種癌癥的發(fā)生，包括黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、腸癌等[15]。本研究表明PHLDA1在胃癌細(xì)胞中呈不同程度高表達(dá)，且在MGC-803細(xì)胞表達(dá)量最高。然而，在胃癌細(xì)胞中PHLDA1于蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)并不完全一致，這可能是由于基因的表達(dá)分為轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)層面，即mRNA水平和蛋白水平。首先，真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯存在時(shí)間和空間間隔，且轉(zhuǎn)錄后加工涉及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解、翻譯、翻譯后加工及修飾幾個(gè)層面；其次，由于檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)不同，可能在蛋白達(dá)到峰值的時(shí)候mRNA已經(jīng)降解或者在mRNA達(dá)到峰值的時(shí)候蛋白量還在增加中。

癌細(xì)胞的顯著特征是具有無限增殖的能力。研究報(bào)道，PHLDA1是人類小腸和大腸中的上皮干細(xì)胞標(biāo)志物，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和增殖[12]。本研究結(jié)果顯示PHLDA1干擾抑制了MGC-803細(xì)胞的增殖，從而可能延緩腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。

腫瘤細(xì)胞凋亡異常增加會(huì)一定程度抑制腫瘤的進(jìn)展[16]。細(xì)胞凋亡過程涉及半胱天冬酶(caspases)和Bcl-2家族成員的激活。Bax屬Bcl-2家族，是一種促凋亡蛋白[17]；其導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)并激活半胱氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。Caspase-2，-8，-9，10是凋亡的啟動(dòng)子蛋白，Caspase-3，-6，-7是凋亡的執(zhí)行子蛋白[19]。Mondal等[20]研究發(fā)現(xiàn)，磺基石蠟通過促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞中Bax、Caspase-3及Caspase-8等蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌SGC-7901細(xì)胞中，迷佐酸通過激活Caspase-3，-8，-9蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。此外，在口腔癌細(xì)胞中，PHLDA1 siRNA干擾可促進(jìn)Caspase-3活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。在NIH-3T3細(xì)胞中，PHLDA1同樣發(fā)揮著抗凋亡作用[23]。本研究結(jié)果表明，PHLDA1干擾上調(diào)了Cleaved-caspase-8、Caspase-9、Cleaved-caspase-9以及Cleaved-caspase-3的表達(dá)，由此推測(cè)，這些蛋白的異常增加可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。由于本文未檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，有待進(jìn)一步研究。

簡(jiǎn)而言之，本研究結(jié)果顯示PHLDA1的敲減抑制胃癌細(xì)胞增殖，提示PHLDA1可能促進(jìn)胃癌的發(fā)生。

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