王一茗，楊曉月，張新昕

急性心肌梗死（AMI）是全球范圍內(nèi)死亡及致殘的主要原因之一［1］。對(duì)缺血心肌進(jìn)行及時(shí)有效的再灌注，減少缺血帶來的損傷及縮小梗死面積是臨床治療目標(biāo)。然而，再灌注過程中可能引發(fā)缺血再灌注損傷（IRI），細(xì)胞凋亡是IRI過程中的重要環(huán)節(jié)［2］。有研究顯示，缺血預(yù)處理（IP）及其他預(yù)處理手段可發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用，從而減輕由缺血再灌注對(duì)心肌造成的損傷［3-4］。YAN等［5］指出，IP與自噬有許多共同特征，自噬在IP減輕再灌注損傷且保護(hù)心肌方面具有重要作用。而細(xì)胞凋亡又與自噬關(guān)系密切，且存在交互效應(yīng)，兩者具有多個(gè)共同的調(diào)控元件，如Bcl-2、Bax、Caspase-3等。同時(shí)，多項(xiàng)研究均證實(shí)，針灸預(yù)處理可減輕缺血再灌注對(duì)心肌造成的損傷，對(duì)心肌具有保護(hù)作用［6-9］。本研究探討中醫(yī)學(xué)經(jīng)典外治法穴位埋線對(duì)IRI后ZDF大鼠心肌細(xì)胞凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2015年1月—2016年5月，選取SPF級(jí)雄性ZDF大鼠24只，8周齡，體質(zhì)量220～230 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001〕。本研究獲得江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 Tween-20、十二烷基硫酸鈉（SDS）粉末（biotopped試劑公司），Western專用脫脂奶粉（美國BD公司），甲叉雙丙烯酰胺（美國Sigma公司），Western blotting、BeyoECL Plus及IP裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Bcl-2、Bax及Caspase-3試劑盒（Abcam公司），過氧化氫酶（CAT）及一氧化氮（NO）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上?；鄯f生物科技公司）。冷凍離心機(jī)（德國適馬股份有限公司），SDS電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀、垂直凝膠電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad公司），脫色搖床（沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司），全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)（上海TANON科技有限公司）。

1.3 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將ZDF大鼠分為4組，各6只?？瞻捉M常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。缺血再灌注組飼養(yǎng)7 d后缺血30 min，再灌注60 min。缺血預(yù)處理組飼養(yǎng)7 d后缺血5 min，再灌注5 min，反復(fù)3次后，缺血30 min，再灌注60 min。埋線預(yù)處理組第1天對(duì)內(nèi)關(guān)、膻中、心俞穴進(jìn)行埋線，7 d后缺血30 min，再灌注60 min。

1.4 缺血再灌注方法 ZDF大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）麻醉，仰臥并固定于手術(shù)臺(tái)上，剪毛、氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。開胸暴露心臟，剪開心包，冠狀動(dòng)脈左心室前降支位于左心耳下緣約0.15 cm處，繞左室支穿線，線兩端穿聚乙烯小管形成閉環(huán)，術(shù)中連續(xù)觀測(cè)心電圖Ⅱ?qū)?lián)變化，以ST段明顯抬高為心肌缺血成功標(biāo)志，松開閉環(huán)后ST段下降1/2以上為明顯再灌注成功。

1.5 穴位埋線方法 埋線預(yù)處理組選擇內(nèi)關(guān)、膻中、心俞穴進(jìn)行埋線預(yù)處理。內(nèi)關(guān)穴位于前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm，尺橈骨縫間，左右各一，直刺1 mm；膻中穴位于雙乳之間，前正中線上，平第4、5肋間，斜刺1.5 mm；心俞穴位于第5胸椎下，兩旁各一，直刺6 mm。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 血清CAT、NO ZDF大鼠再灌注60 min，用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的采血管采血2 ml，以3 000 r/min離心10 min（離心半徑為10 cm），收集分離血清后靜置于-20 ℃冰箱，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定CAT、NO水平。

1.6.2 心肌組織蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3 動(dòng)物模型制備成功后取心臟，置于4%多聚甲醛與0.25%戊二醛固定液中，-80 ℃冰箱保存。取各組心肌組織，加入3倍體積的組織裂解液，冰水浴中充分研磨成組織勻漿，放置10 min。4 ℃條件下以15 000×g離心10 min；加入蛋白上樣液，沸水煮5 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度。加等量2×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性5 min。每孔加40 μg胞漿蛋白，經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）分離，4 ℃下100 V恒壓轉(zhuǎn)膜。室溫下，用5%脫脂奶粉封膜2 h，加入兔抗鼠抗體（1∶500）或內(nèi)參GAPDH（1∶800）一抗，于4 ℃孵育過夜；洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h；漂洗后ECL發(fā)光，常規(guī)顯影。用Gelpro 4.0凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度比值表示Bcl-2、Bax及Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量。

1.6.3 自噬體和線粒體超微結(jié)構(gòu) 順肌纖維走向，取左心室前壁心肌，切成1 mm×1 mm×1 mm大小。再經(jīng)2.5%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水。經(jīng)包埋，半薄切片，光學(xué)固定，超薄切片、銅網(wǎng)承載，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清CAT及NO水平 各組ZDF大鼠血清CAT、NO水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，缺血再灌注組血清CAT、NO水平低于空白組，缺血預(yù)處理組、埋線預(yù)處理組血清CAT、NO水平高于空白組、缺血再灌注組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 各組ZDF大鼠血清CAT及NO水平比較（x±s）Table 1 Comparison of levels of CAT and NO among four groups of ZDF rats

2.2 心肌組織蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3相對(duì)表達(dá)量 各組ZDF大鼠心肌組織蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，缺血再灌注組、缺血預(yù)處理組、埋線預(yù)處理組Bcl-2、Bax及Caspase-3相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，缺血預(yù)處理組、埋線預(yù)處理組Bcl-2、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量高于缺血再灌注組，Bax相對(duì)表達(dá)量低于缺血再灌注組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 自噬體和線粒體超微結(jié)構(gòu) 電鏡下，空白組中未見自噬體，線粒體和心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)均未見異常；缺血再灌注組可見少量的自噬泡，線粒體腫脹明顯，嵴突紊亂、斷裂或消失，心肌細(xì)胞明顯水腫，肌絲斷裂溶解，肌小節(jié)明暗帶模糊不清，細(xì)胞器減少、結(jié)構(gòu)破壞，胞漿內(nèi)形成許多大小不等的空腔及空泡，細(xì)胞膜破裂，且細(xì)胞內(nèi)容物泄漏；與缺血再灌注組相比，缺血預(yù)處理組及埋線預(yù)處理組自噬泡數(shù)量明顯增多，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷較輕（見圖1）。

3 討論

在細(xì)胞發(fā)育、蛋白合成及分化過程中，凋亡與自噬均發(fā)揮十分重要的作用［10］。細(xì)胞凋亡促使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，過度的細(xì)胞凋亡影響組織的正常功能恢復(fù)；而自噬常有利于細(xì)胞的存活，過度的自噬卻會(huì)造成細(xì)胞死亡［11］。研究認(rèn)為，凋亡和自噬存在關(guān)系密切的交互效應(yīng)，或表現(xiàn)為凋亡和自噬共同促使細(xì)胞死亡，或表現(xiàn)為自噬通過抑制凋亡而使細(xì)胞繼續(xù)存活［12-13］。

表2 各組ZDF大鼠心肌組織蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of the relative expression levels of Bcl-2，Bax and Caspase-3 in myocardial tissue among four groups of ZDF rats

表2 各組ZDF大鼠心肌組織蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of the relative expression levels of Bcl-2，Bax and Caspase-3 in myocardial tissue among four groups of ZDF rats

注：與空白組比較，aP＜0.05；與缺血再灌注組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) Bcl-2 Bax Caspase-3空白組 6 0.203 6±0.007 8 0.312 4±0.002 5 0.329 7±0.004 5缺血再灌注組 6 0.372 5±0.002 1a 0.412 3±0.015 2a 0.351 1±0.009 6a缺血預(yù)處理組 6 0.441 7±0.013 9ab 0.347 1±0.016 0ab 1.037 2±0.015 1ab埋線預(yù)處理組 6 0.646 7±0.008 6ab 0.386 5±0.013 4ab 1.180 9±0.012 1ab F值 2 312.671 70.684 11 438.670 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 各組心肌組織電鏡觀察結(jié)果（醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，×8 200）Figure 1 Electron microscopic results of the myocardial tissue of the four groups

心肌IRI的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。大量實(shí)驗(yàn)指出，氧自由基、鈣超載、細(xì)胞凋亡等均可能直接參與再灌注損傷［14-16］。經(jīng)典的IP對(duì)IRI心肌具有保護(hù)作用已得到證實(shí)，其中預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞凋亡與自噬的調(diào)控也經(jīng)過了驗(yàn)證。但I(xiàn)P方法不易操作，有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)，在心肌再灌注開始時(shí)應(yīng)用其他手段或藥物來模擬預(yù)處理機(jī)制，取得了相似的保護(hù)心肌作用［17-18］。

Bcl-2、Bax及Caspase-3作為凋亡與自噬在信號(hào)調(diào)控中具有共同的調(diào)控元件，之間既相互獨(dú)立又緊密聯(lián)系。Bcl-2與Bax是最具有代表性的凋亡蛋白，細(xì)胞凋亡通過心肌IRI被激活，Bcl-2可與Bax形成復(fù)合物，從而抑制凋亡，是抗凋亡蛋白［19］。而當(dāng)Bax增加時(shí)，Bcl-2與Bax形成的復(fù)合物減少，Bcl-2抑制凋亡作用減弱，Bax在誘導(dǎo)凋亡信號(hào)刺激下，聚集到線粒體膜上誘導(dǎo)凋亡，屬于促凋亡蛋白［20］。Caspase-3與Bax相似，是Caspase家族中重要的凋亡執(zhí)行分子，具有促凋亡作用［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注期間，缺血預(yù)處理組及埋線預(yù)處理組Bcl-2、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量高于缺血再灌注組，Bax相對(duì)表達(dá)量低于缺血再灌注組，提示缺血預(yù)處理組和埋線預(yù)處理組可能通過調(diào)控自噬對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用；埋線預(yù)處理可減輕由缺血再灌注對(duì)ZDF大鼠心肌造成的損傷，從而起到保護(hù)心肌的作用。

通過電鏡觀察自噬泡，仍是當(dāng)前判定自噬的黃金標(biāo)準(zhǔn)［22-24］。本研究選擇與臨床更為接近的，患有2型糖尿病及高脂血癥的ZDF大鼠，復(fù)制心肌IRI模型。電鏡下發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，其他各組ZDF大鼠心肌組織均有不同程度梗死及梗死后缺血壞死，提示IRI模型制備成功；與缺血再灌注組相比，缺血預(yù)處理組及埋線預(yù)處理組自噬泡數(shù)量增多，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷減輕；埋線預(yù)處理組與缺血預(yù)處理組IRI明顯減輕，且兩組具有相似的心肌保護(hù)作用。

本研究根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)及經(jīng)典操作，采用的穴位配伍具有一定的實(shí)用性和可操作性。內(nèi)關(guān)、膻中、心俞穴是治療心胸疾患的常用腧穴，臨床常穴對(duì)組合運(yùn)用。內(nèi)關(guān)穴是心包經(jīng)之絡(luò)穴，又是八脈交會(huì)穴之一，與相表里的心經(jīng)相通，并通陰維脈。膻中穴為心包之募穴，心包為心之外圍，替心行令，代心受邪。同時(shí)，氣會(huì)膻中，膻中穴又是八會(huì)穴之一。心俞穴為心經(jīng)背俞穴，采用經(jīng)典的前后配穴法之俞募配穴，可調(diào)暢氣機(jī)、寬胸理氣。作為經(jīng)典外治法的穴位埋線，方法簡(jiǎn)單方便，彌補(bǔ)了針刺、艾灸治療結(jié)束后療效衰減的不足，其發(fā)揮作用持久且穩(wěn)定，在治療慢性疾病方面更具優(yōu)勢(shì)。

值得指出的是，本研究顯示，埋線預(yù)處理與針灸預(yù)處理效果近似，均可提高ZDF大鼠血清CAT、NO水平，對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用，與既往研究結(jié)果一致［25］。埋線預(yù)處理對(duì)自噬的激活，主要通過促進(jìn)Bcl-2和抑制Bax，而對(duì)于Caspase-3，除可激活自噬外，還可激活其他的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，如蛋白的合成以及細(xì)胞代謝等。因而，埋線預(yù)處理對(duì)心肌的保護(hù)作用還可能是通過除自噬外的其他途徑。對(duì)于埋線預(yù)處理治療心肌缺血的作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)和佐證。

本文無利益沖突。

［1］HAUSENLOY D J，YELLON D M.Myocardial ischemia-reperfusion injury：a neglected therapeutic target［J］．J Clin Invest，2013，123（1）：92-100．DOI：10.1172/JCI62874.

［2］劉麗鳳，王禹.細(xì)胞程序性死亡與心肌再灌注損傷的研究進(jìn)展［J］．中華老年心腦血管病雜志，2015，17（5）：549-550．DOI：10.3969/j.issn.1009-0126.2015.05.032.LIU L F，WANG Y.Progress of the study of programmed cell death and myocardial reperfusion injury［J］．Chinese Journal of Senile Cardio Cerebral Vascular Disease，2015，17（5）：549-550．DOI：10.3969/j.issn.1009-0126.2015.05.032.

［3］FUDICKAR A，KUNATH S，VOSS D，et al．Effect of ischemic and pharmacological preconditioning of lower limb muscle tissue on tissue oxygenation measured by near- infrared spectroscopy-a pilot study［J］．BMC Anesthesiology，2014，14（54）：1471-2253．DOI：10.1186/1471-2253-14-54.

［4］潘偉，賈俊海.缺血預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2009，12（8）：649-650，654.PAN W，JIA J H.Effect of ischemic preconditioning on myocardial ischemic/reperfusion injury in diabetic rats［J］．Chinese General Practice，2009，12（8）：649-650，654.

［5］YAN W J，DONG H L，XIONG L Z.The protective roles of autophagy in ischemic preconditioning［J］．Acta Pharmacol Sin，2013，34（5）：636-643．DOI：10.1038/aps.2013.18.

［6］沈菁，王超，張佳麗，等．電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌缺血再灌注損傷家兔SOD與線粒體膜電位的影響［J］．湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué) 報(bào)，2015，35（7）：47-49．DOI：10.3969/j.issn.1674-070X.2015.07.016.SHEN J，WANG C，ZHANG J L，et al．Effect of electroacupuncture at Neiguan point on SOD and mitochondrial membrane potential in rabbits with myocardial ischemiareperfusion injury［J］．Journal of Hunan University of Chinese Medicine，2015，35（7）：47-49．DOI：10.3969/j.issn.1674-070X.2015.07.016.

［7］GAO J，ZHAO Y，WANG Y，et al．Anti-arrhythmic effect of acupuncture pretreatment in the rats subjected to simulative global ischemia and reperfusion—involvement of intracellular Ca2+and connexin 43［J］．BMC Complementary Altern Med，2015，15：5．DOI：10.1186/s12906-015-0521-y.

［8］HUANG Y，LU S F，HU C J，et al．Electro-acupuncture at Neiguan pretreatment alters genome-wide gene expressions and protects rat myocardium against ischemia-reperfusion［J］．Molecules，2014，19（10）：16158-16178．DOI：10.3390/molecules191016158.

［9］王一茗，孫忠人.艾灸預(yù)處理對(duì)心肌缺血高脂血癥大鼠心肌RyR2 mRNA的影響［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（5）：1164-1167.WANG Y M，SUN Z R.Effect of moxibustion preconditioning on RyR2 mRNA in myocardial ischemia and hyperlipidemia rats［J］．Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2011，26（5）：1164-1167.

［10］HARA T，NAKAMURA K，MATSUI M，et al．Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice［J］．Nature，2006，441（7095）：885-889．DOI：10.1038/nature04724.

［11］王玲，張盼盼，王紅陽，等．線粒體自噬對(duì)間歇低氧早期大鼠認(rèn)知功能影響的初探［J］．中華結(jié)核和呼吸雜志，2014，37（11）：840-844．DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2014.11.011.WANG L，ZHANG P P，WANG H Y，et al．The effect of mitochondrial autophagy on cognitive function in rats at the early stage of intermittent hypoxia［J］．Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Medicine，2014，37（11）：840-844．DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2014.11.011.

［12］HANADA T，NODA N N，SATOMI Y，et al．The Atg12-Atg5 conjugate has a novel E3- like activity for protein lipidation in autophagy［J］．J Biol Chem，2007，282（52）：37298-37302．DOI：10.1074/jbc.C700195200.

［13］PANKIV S，CLAUSEN T H，LAMARK T，et al．p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy［J］．J Biol Chem，2007，282（33）：24131-24145．DOI：10.1074/jbc.M702824200.

［14］CHEN K，LI G，GENG F，et al．Berberine reduces ischemia/reperfusion-induced myocardial apoptosis via activating AMPK and PI3K-Akt signaling in diabetic rats［J］．Apoptosis，2014，19（6）：946-957．DOI：10.1007/s10495-014-0977-0.

［15］MA H J，LI Q，GUAN Y，et al．Chronic intermittent hypobaric hypoxia ameliorates ischemia/reperfusion-induced calcium overload in heart via Na+/Ca2+exchanger in developing rats［J］．Cell Physiol Biochem，2014，34（2）：313-324．DOI：10.1159/000363001.

［16］CHOUCHANI E T，PELL V R，JAMES A M，et al．A unifying mechanism for mitochondrial superoxide production during ischemia-reperfusion injury［J］．Cell Metab，2016，23（2）：254-263．DOI：10.1016/j.cmet.2015.12.009.

［17］TIAN Y，LI H，LIU P，et al．Captopril pretreatment produces an additive cardioprotection to isoflurane preconditioning in attenuating myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits and in humans［J］．Mediators Inflamm，2015：819232．DOI：10.1155/2015/819232.

［18］YANG F，YIN C，XI L，et al．Hydroxychloroquine pretreatment reduces myocardial ischemia-reperfusion injury：role of cardiac extracellular-signal-regulated kinase 5 and autophagy［J］．Circulation，2015，132（Suppl 3）：A10246.

［19］JAIN M V，PACZULLA A M，KLONISCH T，et al．Interconnections between apoptotic，autophagic and necrotic pathways：implications for cancer therapy development［J］．J Cell Mol Med，2013，17（1）：12-29．DOI：10.1111/jcmm.12001.

［20］LALIER L，CARTRON P F.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis［J］．Apoptosis，2007，12（5）：887-896．DOI：10.1007/s10495-007-0749-1.

［21］SOHN E J，LI H，REIDY K，et al．EWS/FLI1 oncogene activates caspase 3 transcription and triggers apoptosis in vivo［J］．Cancer Res，2010，70（3）：1154-1163．DOI：10.1158/0008-5472.

［22］RABINOWITZ J D，WHITE E.Autophagy and metabolism［J］．Science，2010，330（6009）：1344-1348．DOI：10.1126/science.1193497.

［23］NICKLIN P，BERGMAN P，ZHANG B，et al．Bidirectional transport of amino acids regulates mTOR and autophagy［J］．Cell，2009，136（3）：521-534．DOI：10.1016/j.cell.2008.11.044.

［24］WU Y T，TAN H L，HUANG Q，et al．Activation of the PI3KAkt-mTOR signaling pathway promotes necrotic cell death via suppression of autophagy［J］．Autophagy，2009，5（6）：824-834．DOI：10.4161/auto.9099.

［25］唐關(guān)敏，翟昌林，宋國杰，等．針灸預(yù)處理對(duì)大鼠心肌梗死心肌S100A1蛋白表達(dá)的影響［J］．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015（1）：107-109．DOI：10.13193/j.issn.1673-7717.2015.01.033.TANG G M，ZHAI C L，SONG G J，et al．Effects of acupuncture pretreatment on the expression of myocardial S100A1 protein in myocardial infarction rats［J］．Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2015（1）：107-109．DOI：10.13193/j.issn.1673-7717.2015.01.033.