(首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)是具有自旋的原子核在外磁場(chǎng)作用下發(fā)生能級(jí)分裂，并在一定射頻照射的情況下發(fā)生躍遷的現(xiàn)象。核磁共振儀在有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定方面發(fā)揮著重要的作用。

核磁共振技術(shù)除了用于解析化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)外，也可作為一種定量分析方法，即定量核磁技術(shù)(quantitative NMR，QNMR)。核磁共振定量分析是以藥物結(jié)構(gòu)分析為基礎(chǔ)的分析方法，是藥物定量分析領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。核磁共振定量分析早在上世紀(jì)70年代就已提出來(lái)，但是由于儀器靈敏度低，測(cè)定的重現(xiàn)性差等條件限制，其綜合效果并不理想[1]。隨著現(xiàn)代超導(dǎo)高分辨磁場(chǎng)的脈沖傅立葉變換核磁共振儀靈敏度、分析速度的不斷提高，核磁共振定量分析方法相比于經(jīng)典的高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等方法具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[2]：

(1)對(duì)樣品測(cè)試范圍很廣，為通用型檢測(cè)手段，對(duì)任何含H的樣品都可以進(jìn)行檢測(cè)；

(2)對(duì)樣品無(wú)破壞性，實(shí)驗(yàn)完成后樣品可以回收；

(3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程不需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)樣品制備簡(jiǎn)單，儀器檢測(cè)快速，對(duì)于不穩(wěn)定的化合物尤為適用；

(5)同核/異核二維核磁技術(shù)，可以提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，可以同時(shí)完成化合物的定性與定量分析。

我國(guó)已于中國(guó)藥典2010版二部附錄IX中新加入了核磁共振波譜法[3]，核磁共振儀在藥物定性領(lǐng)域已得到較為普遍的應(yīng)用，但是國(guó)內(nèi)在核磁定量技術(shù)方面的研究剛剛起步，多偏重于原理及應(yīng)用[4],關(guān)于如何優(yōu)化儀器參數(shù)去獲取高精準(zhǔn)度定量結(jié)果的研究,少見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

500 MHz核磁共振儀(瑞士Bruker)，分析天平(satorius,BS124S)；液相色譜(安捷倫1200)。

1.2 材料與試劑

維生素C標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；維生素C片(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，批號(hào)5150619)；內(nèi)標(biāo)1,2,4,5-四甲基苯(sigma)；甲醇 (fisher,色譜純)；氘代DMSO(sigma，0.03%TMS)。

1.3 方法

1.3.1 優(yōu)化儀器參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品配制

精確稱取維生素C對(duì)照品0.0221 g，溶于氘代DMSO，加入5mm核磁管中，待其完全溶解，上機(jī)測(cè)試。

1.3.2 NMR供試品溶液配制

精確稱取研磨后的維生素片粉末5份(0.0124 g、0.0208 g、0.0226 g、0.0094 g、0.0134g)，分別加入內(nèi)標(biāo)1,2,4,5-四甲基苯(0.0021 g、0.0018 g、0.0028 g、0.0022 g、0.0023g)，溶于5份氘代DMSO，加入5mm核磁管中，超聲15分鐘，待其完全溶解，上機(jī)測(cè)試。

1.3.3 HPLC標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精密稱取維生素C對(duì)照品0.0204 g，置于25mL容量瓶中，加流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸(5∶95)溶解并稀釋至刻度，搖勻 ；精密量取1mL，置于25mL容量瓶中，再加入甲醇-0.1%磷酸(5∶95)稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液(每1mL中含維生素C 32 μg)。

1.3.4 HPLC供試品溶液配制

維生素C片研磨后稱取0.0206 g，置于25mL容量瓶中，加流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸(5∶95)溶解并稀釋至刻度，搖勻 ；精密量取1mL，置于25mL容量瓶中，再加入甲醇-0.1%磷酸(5∶95)稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液(每1mL中含維生素C 32 μg)。

1.3.5 核磁測(cè)定條件 ppm已經(jīng)不允許使用

使用Bruker標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)參數(shù)PROTON，脈沖序列為zg30，譜寬SW 14.6160，中心頻率O1P 6.402，測(cè)試溫度300 K，觀察頻率500 MHz，脈沖寬度p1 13.42 μs，采樣時(shí)間AQ 1.58 s，延遲時(shí)間d1 1 s，掃描次數(shù)ns 32。

1.3.6 液相色譜條件

色譜柱：Kromasil C18(4.6mm×200mm×5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(5∶95)；柱溫：25℃；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：242nm

2 結(jié)果與分析

2.1 定量特征峰、定量?jī)?nèi)標(biāo)的選擇

QNMR所選內(nèi)標(biāo)應(yīng)滿足純度高，能與被測(cè)樣品溶于同一種溶劑，不與被測(cè)樣品及溶劑反應(yīng)，定量峰易于識(shí)別并且至少要保證有一組峰與被測(cè)物完全分離等要求[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用1,2,4,5-四甲基苯為定量?jī)?nèi)標(biāo)，其苯環(huán)上的兩個(gè)質(zhì)子在化學(xué)位移為δ6.87 處有一尖銳單峰，故選定此峰為內(nèi)標(biāo)定量特征信號(hào)峰。

維生素C為水溶性化合物，具有烯醇式己糖內(nèi)酯立體結(jié)構(gòu)，在水中易溶解，結(jié)構(gòu)式和1H NMR見(jiàn)圖1。

圖1 維生素C的結(jié)構(gòu)式和1H NMR譜

1H NMR譜峰歸屬如下：δ11.09 ppm、δ8.40 ppm分別對(duì)應(yīng)羥基1-H、2-H質(zhì)子信號(hào)，δ5.25 ppm對(duì)應(yīng)于3-H質(zhì)子信號(hào)，4-H質(zhì)子信號(hào)與δ3.36 ppm水峰信號(hào)重疊，δ4.75 ppm對(duì)應(yīng)于6-H質(zhì)子信號(hào)，δ3.84 ppm對(duì)應(yīng)于5-H質(zhì)子信號(hào)，δ3.45 ppm對(duì)應(yīng)于7-H質(zhì)子信號(hào)。由圖可見(jiàn)，δ4.75 ppm質(zhì)子信號(hào)易于識(shí)別，旁邊沒(méi)有別的信號(hào)干擾，因此本實(shí)驗(yàn)利用該峰的積分值計(jì)算維生素C 的含量。

2.2 核磁定量參數(shù)優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)主要考察不同脈沖寬度、采樣時(shí)間、延遲時(shí)間、掃描次數(shù)[6-8]對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果見(jiàn)表1～表4。

表1 不同p1對(duì)相對(duì)峰面積比的影響

隨著p1的增加，樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)定量峰的積分面積比值隨之增大，因此本實(shí)驗(yàn)選取p1=13.42 μs。

表2 不同AQ對(duì)相對(duì)峰面積比的影響

隨著AQ的增加，發(fā)現(xiàn)AQ=1.58s時(shí)As/Ar值最大，故本實(shí)驗(yàn)選取AQ=1.58 s。

表3 不同d1對(duì)相對(duì)峰面積比的影響

隨著d1的增加，發(fā)現(xiàn)d1=1s時(shí)As/Ar值最大，故本實(shí)驗(yàn)選取d1=1 s。

表4 不同ns對(duì)相對(duì)峰面積比的影響

隨著ns的增加，發(fā)現(xiàn)ns>32時(shí)As/Ar增加趨勢(shì)減慢，故本實(shí)驗(yàn)選取ns=32。

2.3 1H NMR譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定維生素C

2.3.1 定量方法

測(cè)定前，使用標(biāo)準(zhǔn)管(90% H2O+10 % D2O)對(duì)儀器進(jìn)行3D勻場(chǎng)，使用0.1% EB標(biāo)準(zhǔn)管精確校準(zhǔn)探頭90°脈沖寬度。測(cè)試供試品的1H NMR譜圖，所有譜圖使用Bruker Topspin軟件處理，每個(gè)供試品的積分面積取5次積分的平均值。按公式(1)計(jì)算供試品中維生素含量[9]。公式用斜體

(1)

公式(1)中，W代表物質(zhì)的質(zhì)量；A代表定量峰積分面積；N代表定量峰所包含的質(zhì)子數(shù)；M代表物質(zhì)分子量；下標(biāo)u和r分別為分析物和內(nèi)標(biāo)物。本實(shí)驗(yàn)中Nu=1(Nu代表分析物δ4.75 ppm的積分面積為1)，Nr=2(Nr代表內(nèi)標(biāo)物δ6.87ppm的積分面積為2)，Mu=176.13，Mr=134.22。

2.3.2 含量測(cè)定

制備含有不同質(zhì)量藥品的待測(cè)樣品5份，分別測(cè)定1H NMR，結(jié)果見(jiàn)表5。

由化學(xué)位移為δ4.75 ppm處信號(hào)峰面積Au計(jì)算結(jié)果為：5份樣品中維生素C的含量分別為81.4%、80.3%、81.4%、81.9%、82.1%，平均含量為81.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.86%。

表5 維生素C含量的核磁共振數(shù)據(jù)

2.4 HPLC測(cè)定維生素C

用單點(diǎn)校正法，定量進(jìn)樣，根據(jù)被測(cè)組分和外標(biāo)組分峰面積比或峰高比計(jì)算被測(cè)組分的含量，計(jì)算得維生素C的含量為79.5%。與核磁共振定量分析法測(cè)得的數(shù)據(jù)基本相符。

3 討論

由于核磁共振定量分析是以結(jié)構(gòu)分析為基礎(chǔ)的分析方法，可以同步完成結(jié)構(gòu)分析、定性分析和定量分析。同時(shí)核磁共振定量分析方法還具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、專一性高和不破壞樣品等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化核磁定量實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)參數(shù)，選定實(shí)驗(yàn)中的最佳值，得到的定量結(jié)果與高效液相色譜定量分析方法的結(jié)果相符合。足夠的采樣時(shí)間可以保證自由衰減信號(hào)衰減完全，從而提高分辨率。合適的延遲時(shí)間可以保證譜圖強(qiáng)度不會(huì)被飽和，有利于對(duì)譜峰進(jìn)行正確的積分。在儀器測(cè)試狀態(tài)調(diào)整到最優(yōu)時(shí)，定量分析結(jié)構(gòu)可以接近高效液相色譜法。

由本實(shí)驗(yàn)可知，核磁共振定量分析法操作簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，可為后續(xù)其它藥物定量分析提供參考。

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