(北京吉天儀器有限公司，北京 100015)

1 前言

茶葉作為天然綠色的健康飲品深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。然而茶葉中的農(nóng)藥殘留對人類的身體健康存在潛在威脅。因此茶葉中農(nóng)殘檢測一直是國內(nèi)外食品監(jiān)管部門的監(jiān)測重點(diǎn)。擬除蟲菊酯是一類能防治多種害蟲的廣譜殺蟲劑，對昆蟲具有強(qiáng)烈的觸殺作用，因其高效低毒，在茶葉、蔬菜、水果種植中使用廣泛[1,2]。茶葉中農(nóng)殘?zhí)崛?，常用的傳統(tǒng)方法有索氏提取[3]、振蕩提取[4]、超聲波提取[5]、微波輔助萃取(MAE)[6-8]等，這些方法自動(dòng)化程度低，溶劑消耗量大，處理時(shí)間長。茶葉中農(nóng)殘分析方法，常用的有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[9,10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11]，液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[13,14]等。本實(shí)驗(yàn)選用的分析方法為GC-MS。

快速溶劑萃取(APLE)是近幾年國內(nèi)發(fā)展較快的有機(jī)分析萃取技術(shù)，具有溶劑用量少，萃取時(shí)間短，萃取效率高等突出優(yōu)點(diǎn)，已在環(huán)境、藥物、食品和聚合物工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[15,16]。由于茶葉含有大量色素、生物堿及酚類化合物等脂溶性物質(zhì)，若不經(jīng)過凈化它們會(huì)在分析中形成干擾，降低分析儀器的靈敏度和使用壽命，從而影響最終分析結(jié)果，因此，樣品萃取后凈化處理是十分必要的。本實(shí)驗(yàn)中，樣品經(jīng)APLE、dSPE凈化、過0.45μm有機(jī)濾膜后，直接進(jìn)GC-MS進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)對影響提取效率的預(yù)熱時(shí)間、熱平衡時(shí)間、靜態(tài)萃取時(shí)間、萃取溫度這些參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化選擇，在優(yōu)化后的參數(shù)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。該方法自動(dòng)化程度高，萃取效率高、凈化效果好、精密度好、分析快速非常適合大批量茶葉中7種擬除蟲菊酯的日常檢測工作。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

儀器：APLE-3500快速溶劑萃取儀(北京吉天儀器有限公司)；GCMS-QP2010SE氣相色譜-質(zhì)譜儀(日本島津)；Rxi?-5MS(30 m×0.25mm ×0.25μm) 色譜柱；TMS-200超級恒溫混勻儀(杭州奧盛儀器有限公司)；3-18R高速離心機(jī)(恒諾儀器)；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。分散固相萃取純化管(dSPE：150mg MgSO4，50mg C18，7.5mg GCB,2mL)CNW?。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氯菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯，購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，濃度均為100 μg/mL。正己烷(色譜純)；丙酮(色譜純)；0.45μm的有機(jī)濾膜(尼龍)。

樣品：實(shí)驗(yàn)用茶葉(市售)樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，混勻，密封，常溫下保存，備用。

2.2 溶液配制

儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確移取100μg/mL 的7種擬除蟲菊酯單標(biāo)溶液，用正己烷分別配制成10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，然后將7種10μg/mL的擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配成1μg/mL的混合儲(chǔ)備溶液。

工作溶液的配制：將1μg/mL的7種擬除蟲菊酯混合儲(chǔ)備溶液用正己烷分別配制成0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

樣品溶液的配制：準(zhǔn)確稱取茶葉樣品1.0000g(精確至0.0001)，硅藻土0.5000g，石英砂2.000g，混合均勻后裝入11mL萃取池中(池底裝有1片纖維濾紙和0.5600g硅藻土)。樣品裝填完畢后置于APLE-3500萃取(萃取條件見表1)。萃取液經(jīng)水浴蒸干后用2mL正己烷復(fù)溶混勻，取出1mL于分散固相萃取純化管中，混勻儀混勻5min、離心機(jī)離心5min后，取上清液經(jīng)0.45μm的有機(jī)濾膜過濾后，供GC-MS分析。

表1 APLE-3500萃取條件

2.3 GC分析條件

進(jìn)樣口溫度270.0℃；進(jìn)樣方式為不分流。色譜升溫程序見表2。離子源溫度250℃，四極桿150℃，連接口溫度為280℃，EI電壓70eV，溶劑延遲10min。離子選擇模式為SIM模式分段掃描，7種分析物的定性離子定量離子選擇見表3。 7種擬除蟲菊酯分離情況良好，見圖1。

表2 GC柱溫箱升溫程序

表3 7種擬除蟲菊酯定量離子和定性離子

圖1 濃度為0.2μg/mL的7種擬除蟲菊酯GC-MS圖

3 結(jié)果與討論

3.1 APLE萃取條件優(yōu)化

3.1.1 萃取溫度

據(jù)報(bào)道[17]，提高溫度能極大地減弱由范德華力、氫鍵、溶質(zhì)分子和樣品基體活性位置的偶極吸引力所引起的溶質(zhì)與基體之間的強(qiáng)的相互作用力。加速了溶質(zhì)分子的解析動(dòng)力學(xué)過程，減小解析過程所需的活化能，降低溶劑的粘度，因而減小溶劑進(jìn)入樣品基體的阻滯，增加了溶劑進(jìn)入樣品基體的擴(kuò)散，使溶劑溶解待測物的容量增加，從而提高萃取效率。然而，溫度過高可能導(dǎo)致某些目標(biāo)物的熱降解，從而導(dǎo)致回收率降低。本實(shí)驗(yàn)在確定其他提取因素的前提下，以萃取溫度為變量，選擇80℃、100℃、120℃和140℃ 4個(gè)溫度進(jìn)行提取效果分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溫度下7種目標(biāo)的加標(biāo)回收率

由考察結(jié)果可知，從80℃到100℃，多數(shù)物質(zhì)的回收率沒有顯著升高，在140℃時(shí)的回收率與120℃的回收率相比，除了氰戊菊酯回收率降低較明顯之外，其他6種菊酯回收率差別不大。可能的原因是溫度高于140℃時(shí)，熱降解作用對氰戊菊酯有影響。因此，選取120℃作為萃取茶葉中7種擬除蟲菊酯的最佳溫度。

3.1.2 預(yù)熱時(shí)間

在APLE萃取過程中，預(yù)熱過程是在萃取池進(jìn)入加熱爐之后加載溶劑之前，目的是通過預(yù)熱減小萃取池及樣品基質(zhì)與加熱爐之間的溫差，從而縮短加載溶劑之后的熱平衡時(shí)間，縮短萃取等待時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)在確定其他提取因素的前提下，以預(yù)熱時(shí)間為變量，考察了預(yù)熱30s，120s，180s 3個(gè)時(shí)間進(jìn)行提取效率分析，結(jié)果如圖3。由圖3可知，預(yù)熱時(shí)間對提取效率的影響不明顯，3個(gè)時(shí)間7種目標(biāo)物的回收率差別不大，這主要原因可能是萃取過程中只要熱平衡時(shí)間及靜態(tài)萃取時(shí)間是足夠的，預(yù)熱時(shí)間對萃取效果影響不大。從縮短整個(gè)萃取過程考慮，選取30s為茶葉中7種擬除蟲菊酯萃取的最佳預(yù)熱時(shí)間。

圖3 不同預(yù)熱時(shí)間下7種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率

3.1.3 熱平衡時(shí)間

熱平衡過程是當(dāng)溶劑加入到萃取池之后，整個(gè)萃取池達(dá)到設(shè)定萃取溫度的熱傳遞過程，若時(shí)間過短，萃取池內(nèi)溶劑不能達(dá)到設(shè)定的最佳萃取溶度，萃取溶劑的粘度和滲透能力達(dá)不到最好的條件，影響萃取效率。時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物一定程度的分解或降解，從而導(dǎo)致提取效率降低。本實(shí)驗(yàn)在其他條件一定的前提下，考察了熱平衡3min、5min、7min 3個(gè)時(shí)間的加標(biāo)回收率，進(jìn)行萃取效果分析，結(jié)果如圖4。當(dāng)熱平衡時(shí)間為3min 時(shí)7種目標(biāo)物的回收率明顯偏低，7min與5min相比7種目標(biāo)的回收率略有下降。原因主要是因?yàn)楫?dāng)熱平衡時(shí)間較短時(shí)，溶劑未能達(dá)到設(shè)溫度，導(dǎo)致溶劑不能很好的滲透到樣品基質(zhì)內(nèi)部，分析物析出較慢，導(dǎo)致回收率較低；熱平衡時(shí)間過長時(shí)，又可能導(dǎo)致熱降解從而回收率降低。因此選取5min為最佳的熱平衡時(shí)間。

圖4 不同熱平衡時(shí)間下7種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率

3.1.4 靜態(tài)萃取時(shí)間

靜態(tài)萃取時(shí)間是影響萃取效率的重要因素之一，時(shí)間過短不利于溶劑更好的滲透到基質(zhì)分子內(nèi)部造成提取效率不高，時(shí)間過長又有可能造成目標(biāo)物的不同程度的分解。確定其他條件，本實(shí)驗(yàn)考察了熱平衡2min、5min、7min 3個(gè)時(shí)間進(jìn)行提取效率分析，結(jié)果如圖5。靜態(tài)萃取2min時(shí)7種目標(biāo)物的回收率均能滿足方法的需求，因此選取靜態(tài)萃取2min為最佳的靜態(tài)萃取時(shí)間。

圖5 不同靜態(tài)萃取時(shí)間條件下7種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率

3.2 基質(zhì)效應(yīng)的考察

由于茶葉基質(zhì)的復(fù)雜性，萃取液雖然經(jīng)過分散固相萃取純化管的凈化，仍然存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)將7種擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用正己烷配制成0.25μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析(峰面積為A)，與空白基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積(B)比較得出基質(zhì)效應(yīng)的大小。定義基質(zhì)效應(yīng)為(B-A)/A*100%。結(jié)果如表4。

表4 7種擬除蟲菊酯在茶葉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)

由考察結(jié)果可知，7種分析物的基質(zhì)效應(yīng)絕對值均小于等于12.2%，表明該實(shí)驗(yàn)方法有效去除了基質(zhì)干擾，基質(zhì)效應(yīng)較小。

3.3 方法定量性考察

3.3.1 方法重復(fù)性

取濃度為0.25μg/mL 的7種擬除蟲菊酯的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6針，考察儀器的重復(fù)性，結(jié)果見表5。方法具有良好的重復(fù)性。

表5 7種擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的儀器重復(fù)性(n=6)

3.3.2 方法的檢出限、定量限及線性

采用空白基質(zhì)配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以7種擬除蟲菊酯的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度(μg/g)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)；以信噪比S/N≥3確定檢出限(LOD)，S/N≥10 確定定量限(LOQ)。結(jié)果如表6 所示，方法在0.02～1μg/g(0.02、0.05、0.1、0.25 、0.5、1μg/g)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)(r)≥0.9993。

表6 7種擬除蟲菊酯線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

3.3.3 方法的回收率及精密度

在基質(zhì)空白中添加7種擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加濃度水平為100ng/g、250ng/g、500ng/g。每個(gè)添加濃度平行測定6次，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表7。由表7可知，方法的回收率為84.3～102.9%，精密度≤5.5%。結(jié)果表明，該方法能夠滿足實(shí)際樣品的測定。

表7 7種擬除蟲菊酯加標(biāo)回收率及RSD(n=6)

續(xù)表7

3.4 樣品分析

應(yīng)用本方法測定了4種茶葉實(shí)際樣品，分別是1#-鐵觀音、2#-綠茶、3#-綠茶、4#-紅茶。測定結(jié)果如表8所示。綠茶中均檢出了聯(lián)苯菊酯，紅茶中檢出了聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和三氟氯氰菊酯。4#-紅茶GC-MS實(shí)際分析分段掃描色譜圖見圖6。

表8 實(shí)際樣品中7種擬除蟲菊酯檢測結(jié)果

續(xù)表8

注：ND為未檢出

圖6 4#-紅茶GC-MS測定色譜圖

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用快速溶劑萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(APLE-GC/MS)，建立了茶葉中7種擬除蟲菊酯的檢測方法，并對影響APLE萃取效果的因素進(jìn)行了優(yōu)化考察。結(jié)果表明，當(dāng)萃取溫度為120℃、預(yù)熱時(shí)間30s、熱平衡5min、靜態(tài)萃取2min時(shí)，7種擬除蟲菊酯的加標(biāo)回收率均很好的達(dá)到了分析方法的要求。該方法提取效率高，穩(wěn)定性好，操作簡便。尤其是APLE的高效快捷萃取結(jié)合分散固相萃取純化管凈化，大大縮短了整個(gè)分析過程所用的時(shí)間，十分適合茶葉中7種擬除蟲菊酯的日常檢測。

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