孫靜娟 邱景璇 曾海娟 丁承超 王廣彬 李杰 王淑娟 劉箐

（1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2. 徐州綠健乳品飲料有限公司，徐州 221006）

單增李斯特菌是一種兼性厭氧細(xì)菌，同時(shí)也是胞內(nèi)寄生菌，能夠引起李斯特菌病。李斯特菌病的易感人群包括新生兒、孕婦、老年人和免疫受損的病人，感染死亡率極高［1-2］。單增李斯特菌廣泛存在于自然環(huán)境中，可以在冷藏溫度下生長(zhǎng)繁殖，并能夠在較寬泛的鹽濃度、溫度和pH值條件下生存，使得其在食品加工企業(yè)很難得到控制［3］。另外，單增李斯特菌能夠黏附在食品加工器械上形成菌膜以逃避外界對(duì)它的殺傷，進(jìn)而增加食品污染的可能性［4］。因此，能夠準(zhǔn)確高效地檢出樣品中單增李斯特菌就顯得非常重要。

相關(guān)學(xué)者研究了單增李斯特菌cdaA的結(jié)構(gòu)域分布及表達(dá)模式，并衍射出CdaA晶體結(jié)構(gòu)［5-6］。cdaA編碼的腺苷酸環(huán)化酶CdaA，催化線性二腺苷酸環(huán)化成環(huán)二腺苷酸（Cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP），c-di-AMP作為第二信使參與重要的細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞壁代謝、維持DNA完整性、離子通道、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)［7］。最重要的是，c-di-AMP作為分泌因子能刺激宿主細(xì)胞胞質(zhì)反應(yīng)，激發(fā)先天免疫的胞漿途徑［8］。腺苷酸環(huán)化酶的過表達(dá)能引起宿主細(xì)胞在感染期間機(jī)體免疫反應(yīng)增強(qiáng)。研究表明，多種不同的菌群都能產(chǎn)生c-di-AMP［9］，海棲熱袍菌中DNA完整性掃描蛋白質(zhì)DisA首次發(fā)現(xiàn)腺苷酸環(huán)化酶［10］。除了DisA環(huán)化酶，枯草芽孢桿菌還依賴CdaA環(huán)化酶和CdaS環(huán)化酶協(xié)作調(diào)節(jié)c-di-AMP水平［11］，但單增李斯特菌只有一種CdaA類型的環(huán)化酶協(xié)作調(diào)節(jié)c-di-AMP水平。環(huán)化酶CdaA缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)遲緩［12］，因而CdaA在單增李斯特菌增殖過程中起到重要作用。

利用生物信息學(xué)工具從海量數(shù)據(jù)中篩選出來的單增李斯特菌cdaA具有種內(nèi)保守、種間特異的特點(diǎn)，抗原表位預(yù)測(cè)顯示CdaA具有良好的抗原表位，所以本研究對(duì)CdaA進(jìn)行免疫學(xué)驗(yàn)證，以CdaA為檢測(cè)靶標(biāo)檢測(cè)單增李斯特菌。CdaA的N端存在的跨膜區(qū)可能會(huì)使得CdaA的表達(dá)受阻，所以構(gòu)建pET30a系統(tǒng)原核表達(dá)Δ100CdaA，Ni柱純化后以Δ100CdaA為免疫原制備多克隆抗體和單克隆抗體，并測(cè)定了單抗的性質(zhì)。本研究嘗試用生物信息學(xué)篩選檢測(cè)靶標(biāo)并進(jìn)行免疫學(xué)驗(yàn)證，旨為篩選合理的檢測(cè)靶標(biāo)提供新的思路及為檢測(cè)單增李斯特菌奠定實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及培養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)菌株均由上海理工大學(xué)微生物研究所提供（表1），所有菌株均在37℃用腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）培養(yǎng)。

表1 33株實(shí)驗(yàn)李斯特菌

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；高保真酶試劑盒（Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase）和一步克隆試劑盒（One Step Cloning Kit）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒（One Step Bacterial Active Protein Extraction Kit）和His標(biāo)簽純化柱（Ni-IDA-Sefinose Column）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖割膠回收試劑盒（BioSpin Gel Extraction Kit）和質(zhì)粒抽提試劑盒（BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit）購自杭州博日科技生物有限責(zé)任公司；HAT培養(yǎng)基購自Sigma公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Costar公司；小鼠單抗亞型鑒定試劑盒購自洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心。

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 EGD-e菌株是研究單增李斯特菌的模式菌株，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上公布的單增李斯特菌EGD-e菌株上cdaA序列（Gene ID：984739）運(yùn)用Primer3設(shè)計(jì)擴(kuò)增cdaA的特異性引物F1-R1，引物信息見表2。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。割膠回收PCR產(chǎn)物連接至pET30a載體，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。抽提質(zhì)粒，送上海華大基因科技有限公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果運(yùn)用MEGA 5.0構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。

表2 引物信息

1.2.2 CdaA的生物信息學(xué)分析 運(yùn)行綜合性數(shù)據(jù)庫NCBI上的ORF finder工具分析cdaA開放閱讀框。運(yùn)行ExPASy的ProtParam程序分析預(yù)測(cè)CdaA的理化性質(zhì)［13］。運(yùn)行SignalP4.1 Server程序預(yù)測(cè)CdaA是否含有信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)。運(yùn)行TMHMM Server v.2.0程序預(yù)測(cè)CdaA是否為膜上蛋白及其跨膜區(qū)域。運(yùn)行DNAstar 軟件的 protean程序預(yù)測(cè)CdaA的線性抗原表位［14-17］；運(yùn)行SEPPA 2.0程序預(yù)測(cè)CdaA的空間抗原表位［18-19］。

1.2.3 原核表達(dá)與純化

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì) 前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CdaA的誘導(dǎo)表達(dá)效果不明顯，優(yōu)化誘導(dǎo)條件也不能提高表達(dá)水平，考慮到CdaA的跨膜區(qū)會(huì)阻礙原核表達(dá)，所以根據(jù)NCBI上公布的cdaA序列運(yùn)用Primer3設(shè)計(jì)特異性引物F2-R2，用于擴(kuò)增Δ300cdaA片段，即缺少形成跨膜區(qū)的第1-300 bp的基因片段，引物信息見表2。

1.2.3.2 Δ300cdaA的擴(kuò)增與克隆 根據(jù)高保真酶試劑盒的推薦參數(shù)設(shè)置PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 95℃ 3 min；變性95℃ 15 s，退火56℃ 15 s，延伸72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；徹底延伸72℃ 5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，割膠回收Δ300cdaA片段并克隆至pET30a載體上，將pET30a-Δ300cdaA轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，PCR鑒定為陽性的菌落，抽提質(zhì)粒送上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。

1.2.3.3 Δ100CdaA的原核表達(dá)與可溶性分析 培養(yǎng)含pET30a-Δ300cdaA重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3），37℃，200 r/min，培養(yǎng)至OD600nm為0.6時(shí)加入 IPTG 誘導(dǎo) pET30a-Δ300cdaA表達(dá) Δ100CdaA，IPTG終濃度0.1 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間4 h。誘導(dǎo)完成后，采用一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒從大腸桿菌BL21（DE3）中提取可溶性蛋白，之后用8 mol/L尿素處理包涵體，SDS-PAGE和Western blotting鑒定重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

1.2.3.4 Δ100CdaA的分離純化 Δ100CdaA誘導(dǎo)表達(dá)完成后離心收集菌體，PBS緩沖液重懸菌體，使用超聲破碎儀冰浴破碎菌體，離心棄去上清，用6 mol/L鹽酸胍變性包涵體，參照Ni柱說明書純化His標(biāo)簽重組蛋白并鑒定目的蛋白的純化效果。

1.2.4 動(dòng)物免疫 適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，以純化的Δ100CdaA為免疫原，采用背部皮下多點(diǎn)免疫的方式免疫動(dòng)物，2 kg大耳兔的免疫劑量為1 mg蛋白；8周齡的小鼠的免疫劑量為60 μg的蛋白。初次免疫時(shí)弗氏完全佐劑與免疫原等體積混合乳化后免疫，之后免疫時(shí)使用弗氏不完全佐劑，間隔兩周免疫一次［20］。

1.2.5 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定及Western blotting 分析 三免后一周耳邊緣取血，以純化的Δ100CdaA包板，以梯度稀釋的兔血清為一抗（稀釋度為1∶1 000-1∶128 000），以HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗，采用間接ELISA法檢測(cè)血清中抗體水平［21］。溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取單增李斯特蛋白［22］，SDS-PAGE電泳并將蛋白條帶印跡至NC膜上，以兔血清為一抗，以熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗，使用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)Odyssey掃描NC膜，分析多抗與單增李斯特菌提取蛋白的結(jié)合能力。

1.2.6 單克隆抗體的制備 三免后一周斷尾采血，間接ELISA測(cè)定小鼠血清中特異性抗體水平?？贵w效價(jià)最高的小鼠在沖擊免疫后用于細(xì)胞融合。實(shí)驗(yàn)中以50% PEG（MW1500）作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用HAT培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，間接ELISA法測(cè)定孔板細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的效價(jià)，采用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行亞克隆，篩選出既由單個(gè)細(xì)胞分裂而成又能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的細(xì)胞株。將篩選的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，注射入小鼠腹腔誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腹水，從而獲得大量單克隆抗體。

1.2.7 單克隆抗體性質(zhì)的測(cè)定

1.2.7.1 單克隆抗體的純化 收集腹水，飽和硫酸銨沉淀法粗提抗體后，使用蛋白純化儀protein G柱單抗精提，SDS-PAGE電泳測(cè)定抗體純化效果。

1.2.7.2 單克隆抗體亞型測(cè)定及效價(jià)測(cè)定 采用間接ELISA法測(cè)定鼠源單克隆抗體的亞型，以1 000倍稀釋的單抗為一抗，以6種HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA）為二抗，避光顯色20 min后，藍(lán)色孔對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗的亞型就是單抗的亞型。以梯度稀釋的單抗為一抗（稀釋度為1∶1 000-1∶512 000），以HRP標(biāo)記的山羊抗鼠抗體為二抗，間接ELISA檢測(cè)單抗的效價(jià)。

1.2.7.3 單克隆抗體特異性測(cè)定 培養(yǎng)單增李斯特菌（EGD-e、ATCC43251、ATCC13932、ATCC191-12、ATCC19114、ATCC19115、ATCC19116、ATCC-19117、CMCC 54002）、非致病李斯特菌（CICC216-72、CICC21663和CICC10297）、大腸桿菌O157∶H7（ATCC43895、ATCC43889）、金黃色葡萄球菌（ATCC27660）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）、腸炎沙門氏菌（ATCC13076）、阪崎腸桿菌（ATCC29004）、福氏志賀氏菌（ATCC12022）共19株細(xì)菌。按溶菌酶-超聲破碎-TCA-丙酮沉淀法提取細(xì)菌全蛋白，Western blotting法測(cè)定該單抗的特異性。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析

實(shí)驗(yàn)室保存的26株李斯特菌基于cdaA建立NJ進(jìn)化樹，如圖1所示，由進(jìn)化樹分析可知cdaA在單增李斯特菌中高度保守。將cdaA序列提交至NCBI上Nucleotide collection數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，顯示同源性＞98%。

圖1 基于cdaA核酸序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹

2.2 CdaA的生物信息學(xué)分析

cdaA全長(zhǎng)822 bp作為一個(gè)開放閱讀框，編碼273個(gè)氨基酸。經(jīng)ProtParam 程序分析，CdaA分子量為30.44 kD，等電點(diǎn)理論值7.91，酸性氨基酸總數(shù)（Asp + Glu）為29個(gè)，堿性氨基酸總數(shù)（Arg +Lys）為30個(gè)，不穩(wěn)定指數(shù)為40.83，屬不穩(wěn)定蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為118.57，平均親水系數(shù)為0.241，為疏水性蛋白，不可溶。

2.2.1 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 如圖2，表3所示，信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示信號(hào)肽分值S平均值（mean S-score）＜0.5［23］，表明CdaA不存在信號(hào)肽片段，不是分泌蛋白。

圖2 CdaA信號(hào)肽預(yù)測(cè)

表3 CdaA信號(hào)肽預(yù)測(cè)的數(shù)值信息

2.2.2 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 如圖3，表4所示，跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果表明CdaA 的N端大約前80個(gè)氨基酸肽鏈來回穿梭細(xì)胞膜存在兩個(gè)跨膜區(qū)。

圖3 CdaA跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表4 CdaA跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的數(shù)值信息

2.2.3 線性抗原表位預(yù)測(cè) 運(yùn)用DNAstar軟件預(yù)測(cè)線性抗原表位的結(jié)果如圖4所示，圖上縱坐標(biāo)表示抗原指數(shù)，得分大于0，則該位置容易形成抗原表位?？芍蠹s前80個(gè)氨基酸不構(gòu)成抗原表位，原因可能是這些氨基酸嵌入膜結(jié)構(gòu)，未暴露出來構(gòu)成抗原表位，與跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.2.4 空間抗原表位預(yù)測(cè) 將CdaA空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)提交至SEPPA2.0服務(wù)器預(yù)測(cè)空間抗原表位，0到1表示氨基酸打分，分值越高顏色越紅，則表示該氨基酸越有可能成為抗原表位。如圖5所示，紅色區(qū)域裸露在外側(cè)且分布相對(duì)集中，顯示CdaA具有良好的空間抗原表位。

2.3 Δ300cdaA的擴(kuò)增與pET30a-Δ300cdaA的鑒定

以單增李斯特菌EGD-e菌株為模板，以F2-R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為522 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖6）。重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果如圖7所示，在522 bp處出現(xiàn)陽性條帶，與預(yù)期片段大小一致，說明Δ300cdaA克隆至pET30a載體上，并成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的cdaA序列同源性100%。

2.4 Δ100CdaA的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

SDS-PAGE結(jié)果（圖8-A）顯示，重組質(zhì)粒pET30a-Δ300cdaA的誘導(dǎo)表達(dá)效果明顯，在23 kD處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，并且Δ100CdaA在BL21（DE3）菌體內(nèi)以包涵體的形式存在。Western blotting結(jié)果（圖8-B）顯示在23 kD處呈現(xiàn)出特異性條帶，表明該蛋白能與抗His抗體特異性結(jié)合，證實(shí)是Δ100CdaA。

2.5 Δ100CdaA的分離純化

采用鎳柱對(duì)Δ100CdaA 進(jìn)行純化，SDS-PAGE（圖9-A）分析表明純化效果明顯，在23 kD 處出現(xiàn)蛋白條帶；經(jīng)Western blotting分析（圖9-B）在23 kD處出現(xiàn)特異性條帶，確實(shí)是Δ100CdaA。

圖4 CdaA線性抗原表位預(yù)測(cè)

圖5 CdaA空間抗原表位預(yù)測(cè)

圖6 Δ300cdaA的擴(kuò)增

圖7 重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.6 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

采用間接ELISA法測(cè)兔血清效價(jià)，OD450nm值大于陰性對(duì)照的2.1倍即可認(rèn)定為最終效價(jià)。由圖10可知，以Δ100CdaA多次免疫大耳兔后，兔子血清抗體水平較高，效價(jià)可達(dá)到1∶128 000。

圖8 Δ100CdaA的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

圖9 Δ100CdaA的純化及鑒定

圖10 兔子血清效價(jià)的測(cè)定

2.7 Western blotting檢測(cè)單增李斯特菌

在單增李斯特菌中cdaA編碼的CdaA分子量為30 kD，由圖11可知，在大約30 kD的位置呈現(xiàn)出蛋白印跡，與預(yù)測(cè)大小相符，兔多抗可與從單增李斯特菌中提取的CdaA結(jié)合，表明已成功制備多抗，但是多抗與其他雜蛋白存在交叉，特異性有待提高。

圖11 多抗檢測(cè)單增李斯特菌

2.8 單克隆抗體的純化

如圖12所示，泳道1為飽和硫酸銨沉淀法粗提的單抗，泳道2為親和層析柱純化過程中的穿透液，在55 kD左右沒有目標(biāo)蛋白條帶，表明在純化過程中抗體沒有丟失，泳道3為洗脫的單抗，在55 kD左右有一明顯條帶，為抗體的重鏈，在26 kD左右有一明顯條帶，為抗體輕鏈，除此之外沒有雜帶，表明純化后單抗純度較高。

2.9 單克隆抗體亞型的測(cè)定及效價(jià)測(cè)定

經(jīng)細(xì)胞融合、有限稀釋法篩選出一株雜交瘤細(xì)胞3F8F11C4D3，亞型測(cè)定結(jié)果（表5）顯示抗體亞型為IgG2a。間接ELISA測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)可達(dá)1∶512 000，如圖13所示。

圖12 單抗的純化

表5 單抗亞型的測(cè)定

圖13 單抗效價(jià)的測(cè)定

2.10 單克隆抗體特異性測(cè)定

Western blotting分析該單抗與9株單增李斯特菌、3株非致病李斯特菌以及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等7株其他菌種的交叉反應(yīng)，結(jié)果如圖14、圖15所示，該單抗能夠與9株致病性單增李斯特菌和2株非致病李斯特菌蛋白結(jié)合，并且與7株其他菌種的蛋白不存在交叉，因而，該抗體具有較好的特異性。

3 討論

圖14 單抗與李斯特菌的交叉反應(yīng)結(jié)果

圖15 單抗與其他致病菌的交叉反應(yīng)結(jié)果

通過生物信息學(xué)的方法在數(shù)據(jù)庫中篩選出單增李斯特菌中種內(nèi)保守、種間特異的蛋白CdaA，然后用DNAstar軟件和SEPPA2.0程序預(yù)測(cè)其具有良好的抗原表位，DNAstar 軟件綜合考慮二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性和表面可及性等多個(gè)因素預(yù)測(cè)線性抗原表位［24］；SEPPA2.0程序是以蛋白三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)空間抗原表位，但每種預(yù)測(cè)方法都有一定的局限性，加上體內(nèi)免疫應(yīng)答機(jī)制復(fù)雜，預(yù)測(cè)的抗原表位是否具有免疫原性還需要進(jìn)一步免疫學(xué)驗(yàn)證。

前期原核表達(dá)CdaA效果不佳，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件也不能提高蛋白表達(dá)量，這可能與N端存在跨膜區(qū)相關(guān)。跨膜蛋白在原核表達(dá)過程中受阻一方面是由于結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜性，鑲嵌在膜中的蛋白質(zhì)呈α螺旋結(jié)構(gòu)；另一方面是由于功能多樣性，膜蛋白作為離子通道具有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，也可作為信號(hào)分子具有傳遞信號(hào)的功能，為維持細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)定平衡，膜蛋白的合成可能受到嚴(yán)格調(diào)控［25-26］?？缒^(qū)肽段嵌于膜內(nèi)，呈α螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)規(guī)則且不易變形，決定了跨膜區(qū)氨基酸不易形成抗原表位。線性抗原表位預(yù)測(cè)顯示CdaA的N端形成跨膜區(qū)的前100個(gè)氨基酸確實(shí)不易形成抗原表位，抗原表位多分布在非跨膜區(qū)，因而可采取分段表達(dá)的方式表達(dá)非跨膜區(qū)蛋白［27-28］。

在此基礎(chǔ)上，原核表達(dá)了Δ100CdaA，以Δ100CdaA為免疫原制備的多抗效價(jià)可達(dá)1∶128 000，該多抗能夠與從單增李斯特菌提取的CdaA結(jié)合，但是多抗本身具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，特異性有待提高。制備的單抗效價(jià)可達(dá)1∶512 000，能夠檢測(cè)9株單增李斯特菌和2株非致病李斯特菌，與大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等7株其他致病菌無交叉，特異性較好。雖然制備的多克隆抗體和單克隆抗體不能直接結(jié)合單增李斯特菌，只能夠通過提取細(xì)菌蛋白來檢測(cè)單增李斯特菌，因而無法實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，但是這些不足是可以選擇更合理的檢測(cè)靶標(biāo)及保持免疫原的空間結(jié)構(gòu)解決。本研究對(duì)于用生物信息學(xué)篩選檢測(cè)靶標(biāo)以制備特異性高、廣譜性好的單增李斯特菌抗體的這一想法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建cdaA進(jìn)化樹和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因在單增李斯特菌中高度保守，運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CdaA存在良好抗原表位，CdaA原核表達(dá)受阻可能與該蛋白N端存在跨膜區(qū)有關(guān)。原核表達(dá)并純化了Δ100CdaA，Δ100CdaA蛋白具有良好的免疫原性，以Δ100CdaA制備的多抗效價(jià)可達(dá)1∶128 000，制備的單抗效價(jià)可達(dá)1∶512 000，多抗和單抗均可與從單增李斯特菌提取的CdaA結(jié)合，并且單抗具有良好的特異性。

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