王藝橋 趙新杰 牛芳芳 郭小華 楊博 江元清

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100）

植物在響應(yīng)生物和非生物脅迫過(guò)程中逐漸形成一系列復(fù)雜的應(yīng)對(duì)機(jī)制，其中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制起著極其重要的作用［1］。許多基因均可以被逆境所誘導(dǎo)，特別是一些重要的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，如WRKY、NAC、MYB等［2］。WRKY作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥中共有72個(gè)成員［3］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的命名主要是由于其家族成員都最少含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，即由約60個(gè)氨基酸組成的一段保守序列，其中最保守的是WRKYGQK這7個(gè)氨基酸。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域和靠近C端的一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)（C2H2或C2HC）的不同，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族可以被分為3個(gè)亞族，并且與靶基因的結(jié)合通常被認(rèn)為是通過(guò)W盒（W-box，TTGACC/T）順式作用元件來(lái)進(jìn)行［4］。

植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員已被報(bào)道參與各種生物和非生物脅迫應(yīng)答［5，6］。水稻OsWRKY45存在2個(gè)等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2，在抵抗白葉枯病時(shí)表現(xiàn)出相反的表型［7］。擬南芥WRKY33的過(guò)量表達(dá)可以顯著增加植物對(duì)灰霉病和黑斑病的抵抗力［8］，MPK3/6通過(guò)磷酸化來(lái)激活WRKY33［9］。WRKY25和WRKY33參與擬南芥對(duì)鹽害和熱害的應(yīng)答［10，11］。另外，部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子還參與擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，如葉片衰老［12］、根的發(fā)育［13］以及種皮的發(fā)育［14］等。

關(guān)于植物中WRKY互作蛋白的研究，目前鮮有報(bào)道。除了上述MPK外，植物體內(nèi)的14-3-3蛋白也可以與一些WRKY蛋白形成復(fù)合物，從而介導(dǎo)上游激酶對(duì)WRKY的磷酸化并影響WRKY蛋白的穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)錄活性，擬南芥至少存在8個(gè)WRKY蛋白可以與其形成復(fù)合物［15］。一些VQ蛋白也可以與WRKY蛋白形成二聚體，如VQ16、VQ21和VQ22都可以與AtWRKY33蛋白的WRKY結(jié)構(gòu)域C端結(jié)合，進(jìn)而激活A(yù)tWRKY33的DNA結(jié)合活性［16］。另外，WRKY蛋白之間也可以發(fā)生相互作用。擬南芥中WRKY54和WRKY70都可以作為葉片衰老的負(fù)調(diào)控因子來(lái)延緩葉片的衰老，WRKY30可以分別與AtWRKY54和AtWRKY70發(fā)生互作，推測(cè)WRKY30可能參與植物的衰老調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［17］。Yang等［18］在胡桃中發(fā)現(xiàn)JrWRKY2和JrWRKY7可以形成同源或異源二聚體來(lái)響應(yīng)一些非生物逆境。因此，探究WRKY蛋白與其他成員之間的互作情況，有利于深化對(duì)WRKY蛋白相關(guān)調(diào)控模式的認(rèn)識(shí)。

在前期研究中，發(fā)現(xiàn)擬南芥中WRKY31的轉(zhuǎn)錄本水平能被熱害以及低鉀的短暫處理所抑制，暗示其可能參與對(duì)以上脅迫的快速響應(yīng)，但具體的功能機(jī)制還有待研究。為了探究WRKY31如何調(diào)控植物對(duì)一些非生物脅迫的響應(yīng)，本研究通過(guò)進(jìn)行亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄活性分析實(shí)驗(yàn)，了解其定位及轉(zhuǎn)錄作用。通過(guò)酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)，了解WRKY31能夠與自身以及WRKY6、WRKY42的互作關(guān)系，對(duì)深入闡明該轉(zhuǎn)錄因子的功能與機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 實(shí)驗(yàn)所用材料為擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態(tài)型Col-0；煙草為本氏煙草（Nicotiana benthamiana）。

1.1.2 菌種和載體 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株為DH5α；酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株為AH109；農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株為GV3101。酵母雙雜交（Y2H）載體為pGBKT7和pGADT7（購(gòu)自Clontech公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)引物 使用的普通引物主要通過(guò)手動(dòng)設(shè)計(jì)，并使用http://sg.idtdna.com/calc/analyzer進(jìn)行Tm值檢測(cè)；實(shí)時(shí)定量引物使用DNASTAR Primerselect軟件設(shè)計(jì)，具體信息見(jiàn)表1。

1.1.4 植物生長(zhǎng)條件 擬南芥或煙草種子先用70%乙醇浸泡處理1 min，再用次氯酸鈉處理2 min，最后用滅菌后的蒸餾水清洗5-6次，播種于1/2MS培養(yǎng)基（添加1%蔗糖）平板上，移入4℃冰箱培養(yǎng)2-3 d，后移至溫室中萌發(fā)。待生長(zhǎng)7 d后將幼苗移至Pindstrup基質(zhì)中（購(gòu)自上海品氏托普公司）。溫室植物生長(zhǎng)的光周期為14 h/10 h（光照/黑暗），光照強(qiáng)度為120 μE/m2s，白天溫度為22℃，夜間為20℃，濕度控制在60%-70%。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體的分離與雙熒光素酶報(bào)告分析 擬南芥原生質(zhì)體的分離主要參照Niu等［19］描述的方法，即取生長(zhǎng)4周齡的擬南芥葉片，使用纖維素酶和離析酶處理分離得到原生質(zhì)體，并使用PEG4000介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入分離的原生質(zhì)體中。將AtWRKY31的編碼區(qū)克隆與效應(yīng)載體pRT107-GAL4BD連接。轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體培養(yǎng)24 h，用GloMaxTM20/20 Luminometer熒光計(jì)（Promega）檢測(cè)LUC和REN熒光素酶的活性。

表1 引物序列及用途

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 將擬南芥Col-0種子植于培養(yǎng)皿中豎直生長(zhǎng)7 d，然后將其移入多種處理培養(yǎng)基中或放置于特定溫度的培養(yǎng)箱中，處 理 包 括 50 μmol/L ABA、125 mmol/L NaCl、25%PEG8000、低磷（LP，10 μmol/L PO43-）、低氮（LN，0.25 mmol/L NH4++NO3-）、低鉀（LK，20 μmol/L K+）、10 μmol/L百 草 枯（MV）、5% 葡萄糖（glucose）、冷害（4℃）和熱害（38℃），繼續(xù)豎直生長(zhǎng)1、3和12 h后，每個(gè)處理收取10棵生長(zhǎng)一致的擬南芥幼苗（使用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)），液氮凍存。使用Trizol（生工，上海）進(jìn)行RNA提取，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。提取的RNA首先使用NanoDrop 1000（Thermo Scientific，USA）進(jìn)行濃度檢測(cè)，并通過(guò)電泳檢測(cè)RNA完整性。然后使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）和 Oligo（dT）18（Fermentas）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用總RNA量為5 μg。qRT-PCR反應(yīng)體系為10倍稀釋的cDNA樣品、2×SYBR Mixture（康為世紀(jì)，北京）和正反向引物，混合均勻，放入qPCR儀CFX96（Bio-Rad）上進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)使用2個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。擬南芥內(nèi)參基因使用UBQ10和UBC21，使用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析（*P≤0.05，**P≤0.01）。

1.2.3 酵母雙雜交 將AtWRKY31的編碼區(qū)序列克隆到pGBKT7與pGADT7載體上并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109參考Clontech公司的Yeast Protocol Handbook方法制備，將測(cè)序正確的質(zhì)粒通過(guò)PEG4000介導(dǎo)的方法依次轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中，隨后，將100 μL重懸菌液涂于缺陷型酵母合成培養(yǎng)基（SD-LW）上，培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3 d。將菌落分別接種于不同的酵母合成缺陷培養(yǎng)基（SD-LW、SD-LWH+5 mmol/L 3-AT和ESD-LWHA）上，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，此后需要每天觀察菌落生長(zhǎng)情況，正常情況下4-5 d后可進(jìn)行X-gal染色測(cè)試。

滴定測(cè)試試驗(yàn)，選取二缺合成培養(yǎng)基（SD-LW）上的菌落接種于約4 mL YEPD液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（30℃）12-14 h，隨后測(cè)定菌液的OD600值，再用無(wú)菌水將OD600稀釋至0.5，再按梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)?/10、1/100、1/1 000）。最后將稀釋后的菌液吸取2 μL點(diǎn)于上述3種不同的缺陷培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4-5 d，根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況判斷互作強(qiáng)度并進(jìn)行X-gal染色，及時(shí)拍照記錄。

1.2.4 亞細(xì)胞定位和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) 將AtWRKY31的編碼區(qū)克隆構(gòu)建入pCsGFPBT載體，驗(yàn)證無(wú)誤后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌種中，搖菌過(guò)夜培養(yǎng)后，重懸于含有乙酰丁香酮的培養(yǎng)基（10 mmol/L MES-KOH（pH 5.6）、10 mmol/L MgCl2和 150 μmol/L acetosyringon）中，注射生長(zhǎng)32 d的煙草葉片背面。2 d后，取注射后的煙草葉片制片，并用激光共聚焦顯微鏡（LSM510，Germany）觀察綠色熒光。

雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，首先將AtWRKY31和與其互作蛋白基因的編碼區(qū)分別連入35S-SPYNE（R）173和35S-SPYCE（M）載體［20］，然后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，同上經(jīng)過(guò)培養(yǎng)重懸后進(jìn)行注射生長(zhǎng)32 d的煙草葉片。2 d后取注射后的煙草葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察黃色熒光（Olympus，Japan）。

2 結(jié)果

2.1 AtWRKY31的克隆與亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到AtWRKY31的編碼區(qū)（CDS）序列，并構(gòu)建到含有GFP報(bào)告基因的pCsGFPBT載體中。經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)獲得AtWRKY31的CDS序列，長(zhǎng)度為1 614 bp。蛋白序列比對(duì)表明，AtWRKY31編碼的蛋白含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，具有C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，且與WRKY42和WRKY6同屬WRKY基因家族的第二亞族中的b組（Group IIb）（圖1）。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法使WRKY31在煙草葉片中表達(dá)，然后使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察WRKY31-GFP融合蛋白的定位情況，發(fā)現(xiàn)其僅定位于細(xì)胞核內(nèi)（圖2）。

2.2 AtWRKY31的轉(zhuǎn)錄活性分析

為了研究AtWRKY31的調(diào)控機(jī)制，首先對(duì)AtWRKY31的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了檢測(cè)。將AtWRKY31編碼區(qū)與pRT107-GAL4-BD載體上的GAL4-BD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合，報(bào)告質(zhì)粒分別含有5次串聯(lián)重復(fù)的W盒以及連接有CaMV35S啟動(dòng)子的W盒驅(qū)動(dòng)的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因，內(nèi)參質(zhì)粒為CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的海腎熒光素酶基因（圖3-A）。將各個(gè)報(bào)告質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中，通過(guò)測(cè)定LUC和REN熒光素酶活性，來(lái)分析其轉(zhuǎn)錄活性（圖3-B）。從LUC與REN的比值可以看出，AtWRKY31的值明顯的低于對(duì)照，因此是轉(zhuǎn)錄抑制子。

2.3 AtWRKY31對(duì)于非生物逆境的響應(yīng)分析

為了了解WRKY31可能的生物學(xué)功能，分析了它在多種非生物逆境處理?xiàng)l件下的表達(dá)量變化情況（圖4）。在熱害處理時(shí)，WRKY31的表達(dá)量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著的下調(diào)，在低氮條件下，其表達(dá)量在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)顯著降低，另外，在鹽害、脫落酸（ABA）、百草枯（MV）、低鉀和葡萄糖處理?xiàng)l件下，分別有一個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量出現(xiàn)顯著的變化。

2.4 酵母雙雜交篩選WRKY31的互作蛋白

前期有文獻(xiàn)報(bào)道，WRKY家族中WRKY30可以與WRKY54和WRKY70通過(guò)互作來(lái)調(diào)控植物葉片的衰老。鑒于AtWRKY31是轉(zhuǎn)錄抑制子，通過(guò)酵母雙雜交檢測(cè)了AtWRKY31是否與其自身互作，結(jié)果驗(yàn)證了我們的假設(shè)（圖5，第一行）。此外，篩選了WRKY31與其他在進(jìn)化上相鄰的Group IIb成員之間的互作情況，發(fā)現(xiàn)WRKY31可以分別與自身以及WRKY6、WRKY42和自身發(fā)生互作，并且在酵母體內(nèi)驗(yàn)證了AtWRKY31是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子（圖5，最后一行）。

2.5 雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證蛋白互作

為了進(jìn)一步證實(shí)WRKY31與自身以及其他2個(gè)WRKY蛋白互作的真實(shí)性，在本氏煙草葉片通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行了基于YFP的雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（圖6）。可以看出，在WRKY31與自身以及其他互作蛋白配對(duì)中均能看到明顯的YFP的黃色熒光，而在陰性對(duì)照中沒(méi)有觀察到熒光，進(jìn)一步說(shuō)明了互作的真實(shí)性。

3 討論

干旱、鹽害、熱害和營(yíng)養(yǎng)缺乏等非生物脅迫，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和作物的產(chǎn)量。已有的報(bào)道表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的成員在調(diào)控植物對(duì)生物以及非生物逆境響應(yīng)方面，起著十分重要的作用［21］?？寺〉玫降腤RKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員AtWRKY31的功能還沒(méi)有被報(bào)道，但其同一亞族的部分成員已經(jīng)被研究。比如，AtWRKY6通過(guò)抑制AtPHO1的表達(dá)來(lái)負(fù)調(diào)控植物對(duì)低磷的應(yīng)答［22］。另外也有報(bào)道 AtWRKY6參與調(diào)控?cái)M南芥中硼和砷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)［23］。AtWRKY45和AtWRKY42這 2個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控AtPHT1；1、AtPHT1；1與AtPHO1，進(jìn)而影響植物體內(nèi)磷的相對(duì)平衡［24，25］。擬南芥中許多轉(zhuǎn)錄因子家族成員之間都存在功能的冗余性，而作為同屬于一類(lèi)亞類(lèi)家族的WRKY31可能也具有與AtWRKY6和AtWRKY42同樣的功能［26］。通過(guò)對(duì)擬南芥的WRKY31進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其在多種非生物逆境處理的條件下，表達(dá)量顯著的下調(diào)。轉(zhuǎn)錄活性分析表明AtWRKY31是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子，但是不具有典型的類(lèi)似EAR（Ethyleneresponsive element binding factor-associated amphiphilic repression）的LxLxL或DLNxxP（x代表任意氨基酸殘基）型基序（Motif）［27］，暗示可能是具有新型轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄抑制子。酵母雙雜交和熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WRKY31可以與WRKY42、WRKY6發(fā)生互作，進(jìn)一步暗示了WRKY31可能參與植物體內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)。在植物體內(nèi)，蛋白互作調(diào)控發(fā)揮著重要的作用，如在植物抗病應(yīng)答中，MAPK3/6就是通過(guò)磷酸化作用來(lái)激活下游蛋白的活性［28］。另外，擬南芥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中一些成員也通過(guò)形成同源或異源二聚體的形式來(lái)激活或抑制自身的活性［29，30］。關(guān)于 WRKY31 是否通過(guò)與 WRKY42、WRKY6互作來(lái)影響植物體內(nèi)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)或參與其他調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還需要進(jìn)一步去探究。

圖1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族3個(gè)成員氨基酸序列多重比對(duì)

圖2 AtWRKY31-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位

圖3 AtWRKY31在原生質(zhì)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性分析

圖4 qRT-PCR分析WRKY31在各種逆境下的表達(dá)量變化

4 結(jié)論

以模式生物擬南芥為研究材料，克隆得到WRKY31，其表達(dá)受多種逆境脅迫的抑制。WRKY31定位于核內(nèi)且作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子發(fā)揮作用；WRKY31蛋白可以與其自身和同一家族的成員WRKY42和WRKY6發(fā)生互作。推測(cè)WRKY31可能通過(guò)與WRKY6和WRKY42轉(zhuǎn)錄因子互作的方式來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用。

致謝：BiFC載體由Jorg Kudla教授提供。LUC相關(guān)載體質(zhì)粒由Yoko Nishizawa教授（National Institute of Agrobiological Sciences，Japan）和張勁松研究員（中科院遺傳發(fā)育所）提供，在此表示感謝。

圖5 酵母雙雜交分析擬南芥中WRKY31的互作蛋白

圖6 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證擬南芥中WRKY31蛋白與其他成員之間的互作

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