王藝橋 趙新杰 牛芳芳 郭小華 楊博 江元清

（西北農林科技大學生命科學學院，楊凌 712100）

植物在響應生物和非生物脅迫過程中逐漸形成一系列復雜的應對機制，其中相關基因的轉錄激活或抑制起著極其重要的作用［1］。許多基因均可以被逆境所誘導，特別是一些重要的轉錄因子家族成員，如WRKY、NAC、MYB等［2］。WRKY作為一種重要的轉錄因子家族，在擬南芥中共有72個成員［3］。WRKY轉錄因子的命名主要是由于其家族成員都最少含有一個WRKY結構域，即由約60個氨基酸組成的一段保守序列，其中最保守的是WRKYGQK這7個氨基酸。根據WRKY結構域和靠近C端的一個鋅指結構（C2H2或C2HC）的不同，WRKY轉錄因子家族可以被分為3個亞族，并且與靶基因的結合通常被認為是通過W盒（W-box，TTGACC/T）順式作用元件來進行［4］。

植物WRKY轉錄因子家族成員已被報道參與各種生物和非生物脅迫應答［5，6］。水稻OsWRKY45存在2個等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2，在抵抗白葉枯病時表現出相反的表型［7］。擬南芥WRKY33的過量表達可以顯著增加植物對灰霉病和黑斑病的抵抗力［8］，MPK3/6通過磷酸化來激活WRKY33［9］。WRKY25和WRKY33參與擬南芥對鹽害和熱害的應答［10，11］。另外，部分WRKY轉錄因子還參與擬南芥的生長發(fā)育調控，如葉片衰老［12］、根的發(fā)育［13］以及種皮的發(fā)育［14］等。

關于植物中WRKY互作蛋白的研究，目前鮮有報道。除了上述MPK外，植物體內的14-3-3蛋白也可以與一些WRKY蛋白形成復合物，從而介導上游激酶對WRKY的磷酸化并影響WRKY蛋白的穩(wěn)定性和/或轉錄活性，擬南芥至少存在8個WRKY蛋白可以與其形成復合物［15］。一些VQ蛋白也可以與WRKY蛋白形成二聚體，如VQ16、VQ21和VQ22都可以與AtWRKY33蛋白的WRKY結構域C端結合，進而激活AtWRKY33的DNA結合活性［16］。另外，WRKY蛋白之間也可以發(fā)生相互作用。擬南芥中WRKY54和WRKY70都可以作為葉片衰老的負調控因子來延緩葉片的衰老，WRKY30可以分別與AtWRKY54和AtWRKY70發(fā)生互作，推測WRKY30可能參與植物的衰老調控網絡［17］。Yang等［18］在胡桃中發(fā)現JrWRKY2和JrWRKY7可以形成同源或異源二聚體來響應一些非生物逆境。因此，探究WRKY蛋白與其他成員之間的互作情況，有利于深化對WRKY蛋白相關調控模式的認識。

在前期研究中，發(fā)現擬南芥中WRKY31的轉錄本水平能被熱害以及低鉀的短暫處理所抑制，暗示其可能參與對以上脅迫的快速響應，但具體的功能機制還有待研究。為了探究WRKY31如何調控植物對一些非生物脅迫的響應，本研究通過進行亞細胞定位和轉錄活性分析實驗，了解其定位及轉錄作用。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗，了解WRKY31能夠與自身以及WRKY6、WRKY42的互作關系，對深入闡明該轉錄因子的功能與機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 實驗所用材料為擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態(tài)型Col-0；煙草為本氏煙草（Nicotiana benthamiana）。

1.1.2 菌種和載體 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株為DH5α；酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株為AH109；農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株為GV3101。酵母雙雜交（Y2H）載體為pGBKT7和pGADT7（購自Clontech公司）。

1.1.3 實驗引物 使用的普通引物主要通過手動設計，并使用http://sg.idtdna.com/calc/analyzer進行Tm值檢測；實時定量引物使用DNASTAR Primerselect軟件設計，具體信息見表1。

1.1.4 植物生長條件 擬南芥或煙草種子先用70%乙醇浸泡處理1 min，再用次氯酸鈉處理2 min，最后用滅菌后的蒸餾水清洗5-6次，播種于1/2MS培養(yǎng)基（添加1%蔗糖）平板上，移入4℃冰箱培養(yǎng)2-3 d，后移至溫室中萌發(fā)。待生長7 d后將幼苗移至Pindstrup基質中（購自上海品氏托普公司）。溫室植物生長的光周期為14 h/10 h（光照/黑暗），光照強度為120 μE/m2s，白天溫度為22℃，夜間為20℃，濕度控制在60%-70%。

1.2 方法

1.2.1 原生質體的分離與雙熒光素酶報告分析 擬南芥原生質體的分離主要參照Niu等［19］描述的方法，即取生長4周齡的擬南芥葉片，使用纖維素酶和離析酶處理分離得到原生質體，并使用PEG4000介導轉化法將質粒載體轉入分離的原生質體中。將AtWRKY31的編碼區(qū)克隆與效應載體pRT107-GAL4BD連接。轉入原生質體培養(yǎng)24 h，用GloMaxTM20/20 Luminometer熒光計（Promega）檢測LUC和REN熒光素酶的活性。

表1 引物序列及用途

1.2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 將擬南芥Col-0種子植于培養(yǎng)皿中豎直生長7 d，然后將其移入多種處理培養(yǎng)基中或放置于特定溫度的培養(yǎng)箱中，處 理 包 括 50 μmol/L ABA、125 mmol/L NaCl、25%PEG8000、低磷（LP，10 μmol/L PO43-）、低氮（LN，0.25 mmol/L NH4++NO3-）、低鉀（LK，20 μmol/L K+）、10 μmol/L百 草 枯（MV）、5% 葡萄糖（glucose）、冷害（4℃）和熱害（38℃），繼續(xù)豎直生長1、3和12 h后，每個處理收取10棵生長一致的擬南芥幼苗（使用3個生物學重復），液氮凍存。使用Trizol（生工，上海）進行RNA提取，具體步驟參照說明書。提取的RNA首先使用NanoDrop 1000（Thermo Scientific，USA）進行濃度檢測，并通過電泳檢測RNA完整性。然后使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）和 Oligo（dT）18（Fermentas）進行反轉錄，使用總RNA量為5 μg。qRT-PCR反應體系為10倍稀釋的cDNA樣品、2×SYBR Mixture（康為世紀，北京）和正反向引物，混合均勻，放入qPCR儀CFX96（Bio-Rad）上進行反應。每個反應使用2個技術重復和3個生物學重復。擬南芥內參基因使用UBQ10和UBC21，使用SPSS進行數據顯著性分析（*P≤0.05，**P≤0.01）。

1.2.3 酵母雙雜交 將AtWRKY31的編碼區(qū)序列克隆到pGBKT7與pGADT7載體上并進行測序驗證。酵母感受態(tài)細胞AH109參考Clontech公司的Yeast Protocol Handbook方法制備，將測序正確的質粒通過PEG4000介導的方法依次轉入酵母感受態(tài)細胞中，隨后，將100 μL重懸菌液涂于缺陷型酵母合成培養(yǎng)基（SD-LW）上，培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3 d。將菌落分別接種于不同的酵母合成缺陷培養(yǎng)基（SD-LW、SD-LWH+5 mmol/L 3-AT和ESD-LWHA）上，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，此后需要每天觀察菌落生長情況，正常情況下4-5 d后可進行X-gal染色測試。

滴定測試試驗，選取二缺合成培養(yǎng)基（SD-LW）上的菌落接種于約4 mL YEPD液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（30℃）12-14 h，隨后測定菌液的OD600值，再用無菌水將OD600稀釋至0.5，再按梯度進行稀釋（1/10、1/100、1/1 000）。最后將稀釋后的菌液吸取2 μL點于上述3種不同的缺陷培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4-5 d，根據菌落生長情況判斷互作強度并進行X-gal染色，及時拍照記錄。

1.2.4 亞細胞定位和雙分子熒光互補實驗 將AtWRKY31的編碼區(qū)克隆構建入pCsGFPBT載體，驗證無誤后轉入農桿菌GV3101菌種中，搖菌過夜培養(yǎng)后，重懸于含有乙酰丁香酮的培養(yǎng)基（10 mmol/L MES-KOH（pH 5.6）、10 mmol/L MgCl2和 150 μmol/L acetosyringon）中，注射生長32 d的煙草葉片背面。2 d后，取注射后的煙草葉片制片，并用激光共聚焦顯微鏡（LSM510，Germany）觀察綠色熒光。

雙分子熒光互補實驗，首先將AtWRKY31和與其互作蛋白基因的編碼區(qū)分別連入35S-SPYNE（R）173和35S-SPYCE（M）載體［20］，然后轉入農桿菌GV3101中，同上經過培養(yǎng)重懸后進行注射生長32 d的煙草葉片。2 d后取注射后的煙草葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察黃色熒光（Olympus，Japan）。

2 結果

2.1 AtWRKY31的克隆與亞細胞定位分析

通過RT-PCR擴增得到AtWRKY31的編碼區(qū)（CDS）序列，并構建到含有GFP報告基因的pCsGFPBT載體中。經過測序驗證，確認獲得AtWRKY31的CDS序列，長度為1 614 bp。蛋白序列比對表明，AtWRKY31編碼的蛋白含有一個WRKY結構域，具有C2H2型鋅指結構，且與WRKY42和WRKY6同屬WRKY基因家族的第二亞族中的b組（Group IIb）（圖1）。通過農桿菌介導的方法使WRKY31在煙草葉片中表達，然后使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察WRKY31-GFP融合蛋白的定位情況，發(fā)現其僅定位于細胞核內（圖2）。

2.2 AtWRKY31的轉錄活性分析

為了研究AtWRKY31的調控機制，首先對AtWRKY31的轉錄活性進行了檢測。將AtWRKY31編碼區(qū)與pRT107-GAL4-BD載體上的GAL4-BD結構域進行融合，報告質粒分別含有5次串聯重復的W盒以及連接有CaMV35S啟動子的W盒驅動的螢火蟲熒光素酶基因，內參質粒為CaMV35S啟動子驅動的海腎熒光素酶基因（圖3-A）。將各個報告質粒以及內參質粒一起共轉入擬南芥原生質體中，通過測定LUC和REN熒光素酶活性，來分析其轉錄活性（圖3-B）。從LUC與REN的比值可以看出，AtWRKY31的值明顯的低于對照，因此是轉錄抑制子。

2.3 AtWRKY31對于非生物逆境的響應分析

為了了解WRKY31可能的生物學功能，分析了它在多種非生物逆境處理條件下的表達量變化情況（圖4）。在熱害處理時，WRKY31的表達量在3個時間點都顯著的下調，在低氮條件下，其表達量在2個時間點出現顯著降低，另外，在鹽害、脫落酸（ABA）、百草枯（MV）、低鉀和葡萄糖處理條件下，分別有一個時間點表達量出現顯著的變化。

2.4 酵母雙雜交篩選WRKY31的互作蛋白

前期有文獻報道，WRKY家族中WRKY30可以與WRKY54和WRKY70通過互作來調控植物葉片的衰老。鑒于AtWRKY31是轉錄抑制子，通過酵母雙雜交檢測了AtWRKY31是否與其自身互作，結果驗證了我們的假設（圖5，第一行）。此外，篩選了WRKY31與其他在進化上相鄰的Group IIb成員之間的互作情況，發(fā)現WRKY31可以分別與自身以及WRKY6、WRKY42和自身發(fā)生互作，并且在酵母體內驗證了AtWRKY31是一個轉錄抑制子（圖5，最后一行）。

2.5 雙分子熒光互補驗證蛋白互作

為了進一步證實WRKY31與自身以及其他2個WRKY蛋白互作的真實性，在本氏煙草葉片通過瞬時表達，進行了基于YFP的雙分子熒光互補實驗（圖6）。可以看出，在WRKY31與自身以及其他互作蛋白配對中均能看到明顯的YFP的黃色熒光，而在陰性對照中沒有觀察到熒光，進一步說明了互作的真實性。

3 討論

干旱、鹽害、熱害和營養(yǎng)缺乏等非生物脅迫，嚴重影響植物的生長發(fā)育和作物的產量。已有的報道表明，WRKY轉錄因子家族的成員在調控植物對生物以及非生物逆境響應方面，起著十分重要的作用［21］?？寺〉玫降腤RKY轉錄因子家族成員AtWRKY31的功能還沒有被報道，但其同一亞族的部分成員已經被研究。比如，AtWRKY6通過抑制AtPHO1的表達來負調控植物對低磷的應答［22］。另外也有報道 AtWRKY6參與調控擬南芥中硼和砷酸鹽的轉運［23］。AtWRKY45和AtWRKY42這 2個WRKY轉錄因子分別調控AtPHT1；1、AtPHT1；1與AtPHO1，進而影響植物體內磷的相對平衡［24，25］。擬南芥中許多轉錄因子家族成員之間都存在功能的冗余性，而作為同屬于一類亞類家族的WRKY31可能也具有與AtWRKY6和AtWRKY42同樣的功能［26］。通過對擬南芥的WRKY31進一步研究，發(fā)現其在多種非生物逆境處理的條件下，表達量顯著的下調。轉錄活性分析表明AtWRKY31是一個轉錄抑制子，但是不具有典型的類似EAR（Ethyleneresponsive element binding factor-associated amphiphilic repression）的LxLxL或DLNxxP（x代表任意氨基酸殘基）型基序（Motif）［27］，暗示可能是具有新型轉錄抑制結構域的轉錄抑制子。酵母雙雜交和熒光互補實驗發(fā)現WRKY31可以與WRKY42、WRKY6發(fā)生互作，進一步暗示了WRKY31可能參與植物體內的離子轉運網絡。在植物體內，蛋白互作調控發(fā)揮著重要的作用，如在植物抗病應答中，MAPK3/6就是通過磷酸化作用來激活下游蛋白的活性［28］。另外，擬南芥中bHLH轉錄因子家族中一些成員也通過形成同源或異源二聚體的形式來激活或抑制自身的活性［29，30］。關于 WRKY31 是否通過與 WRKY42、WRKY6互作來影響植物體內的磷轉運或參與其他調控網絡，還需要進一步去探究。

圖1 WRKY轉錄因子家族3個成員氨基酸序列多重比對

圖2 AtWRKY31-GFP融合蛋白的亞細胞定位

圖3 AtWRKY31在原生質體內的轉錄活性分析

圖4 qRT-PCR分析WRKY31在各種逆境下的表達量變化

4 結論

以模式生物擬南芥為研究材料，克隆得到WRKY31，其表達受多種逆境脅迫的抑制。WRKY31定位于核內且作為一個轉錄抑制子發(fā)揮作用；WRKY31蛋白可以與其自身和同一家族的成員WRKY42和WRKY6發(fā)生互作。推測WRKY31可能通過與WRKY6和WRKY42轉錄因子互作的方式來發(fā)揮調控作用。

致謝：BiFC載體由Jorg Kudla教授提供。LUC相關載體質粒由Yoko Nishizawa教授（National Institute of Agrobiological Sciences，Japan）和張勁松研究員（中科院遺傳發(fā)育所）提供，在此表示感謝。

圖5 酵母雙雜交分析擬南芥中WRKY31的互作蛋白

圖6 雙分子熒光互補實驗驗證擬南芥中WRKY31蛋白與其他成員之間的互作

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