◎ 張 威，姜連閣

（黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，黑龍江 哈爾濱 150088）

牛奶中抗生素殘留是我國乃至全球奶牛業(yè)普遍存在的問題。目前，多數(shù)奶牛畜牧場均在使用抗生素類藥物來治療奶牛疾病[1-2]，隨著抗生素類藥物被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，牛奶中抗生素殘留問題日趨受到國內(nèi)外相關(guān)人士的正視，但就國內(nèi)奶牛飼養(yǎng)的大環(huán)境而言，其實基本無法把牛奶做到完全“無抗”的程度，去除牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，β-內(nèi)酰胺酶（生鮮牛乳抗生素分解劑）可能添加到各類乳制品中而起到掩蔽抗生素的作用，但由于現(xiàn)階段并未知曉這一生物制劑的安全性危害評估，乳制品生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)禁在其生產(chǎn)過程中添加β-內(nèi)酰胺酶這一物質(zhì)。隨著公眾對于食品安全問題的關(guān)注度越來越高，我國已經(jīng)將β-內(nèi)酰胺酶列為用于乳及乳制品掩蔽抗生素的非食用違法添加物質(zhì)[3]。

目前，乳制品中的β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法主要有理化法、免疫法、微生物法等，以及以免疫法為基礎(chǔ)研制出的快速檢測試劑盒法[4]。杯碟法是我國當(dāng)前認可的針對牛奶制品的主要檢測方法，但實驗過程較繁瑣、周期較長；碘量法的靈敏度不高、重現(xiàn)性也較差；酸測定法的假陽性和假陰性問題較嚴(yán)重，一直找不到解決辦法；液相色譜法的樣品前處理過程繁瑣，所用儀器對實驗人員要求較高，檢測成本昂貴。相比之下，建立準(zhǔn)確、快速、可靠的快速檢測試劑盒法，不需要對樣品進行復(fù)雜的前處理過程，操作過程簡便且直觀易懂。在實際檢驗檢測工作中，β-內(nèi)酰胺酶檢測方法是否方便、快速、敏感、準(zhǔn)確愈來愈受到各界關(guān)注?，F(xiàn)有的研究中多數(shù)為單一方法的探討，而對于國內(nèi)外快速檢測試劑盒的研究很少，文獻中并未報道過對于試劑盒的評價研究，日常工作中缺少適用于檢測大批量樣品的篩選依據(jù)。

本文選用Charm和華安麥科快速檢測試紙條分別進行牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的檢測，并以杯碟法作為比較，對比其檢測結(jié)果，了解和探討各方法的特點及優(yōu)缺點，為建立不同種類乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗樣品為150份乳制品樣品。藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001，北京嘉世玉禾化工技術(shù)研究院；β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品（3×106U/mL），中國食品藥品檢定研究院；氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.Ehrenstorfer (Germany)；抗生素鑒定培養(yǎng)基Ⅱ，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；牛津杯，深圳新拓撲生物科技有限公司；Charm試劑盒，中檢柏泰生物技術(shù)（北京）有限公司；β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙條，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

調(diào)制乳、滅菌乳等液體乳制品以原液檢測，奶粉樣品按1∶10的比例稀釋后檢測，酸奶樣品經(jīng)離心后，取中層液體按1∶2的比例稀釋，pH調(diào)至6.0后檢測。

選取其中50批陰性樣品，分別添加β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品（3×106U/mL）使其β-內(nèi)酰胺酶終濃度為4 U/mL，以此制成的陽性樣品作為檢測假陰性率的樣本。

1.2.2 檢測方法

（1）杯碟法。按照國家指定方法衛(wèi)生部《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)檢驗方法 杯碟法》進行，以抑菌圈差值在3 mm以上作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

（2）華安麥科β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙條。測定步驟及判定參照試劑盒使用說明進行。

（3）Charm Rosa β-內(nèi)酰胺酶試劑盒。測定步驟及判定參照試劑盒使用說明進行。

1.3 評價方法及分析指標(biāo)

以國家指定方法衛(wèi)生部《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)檢驗方法 杯碟法》為參考基準(zhǔn)方法，用其檢測的結(jié)果評價快檢試劑盒的靈敏度、特異性、符合率（與現(xiàn)有方法一致性分析）及Youden指數(shù)，快檢試劑盒定性方法的性能指標(biāo)計算方式見表1，樣品情況為由基準(zhǔn)方法檢驗得到的結(jié)果，其中靈敏度為參比陽性樣品的檢出率；特異性為參比陰性樣品的陰性率；符合率為快檢方法與參比方法檢測結(jié)果一致的樣品數(shù)與樣品總數(shù)之比；Youden指數(shù)由公式（1）計算得出。

表1 定性方法性能指標(biāo)計算表

2 結(jié)果與分析

2.1 杯蝶法及快檢試劑盒法的檢測結(jié)果

從市場上購買不同品牌的液態(tài)乳和奶粉樣品，采用杯碟法和快速檢測法分別對購置的乳及乳制品進行檢測，采用杯碟法在檢出限濃度（4 U/mL）下測定（其中A加入10 μL氨芐青霉素、B加入10 μL氨芐青霉素+50 μL舒巴坦、C加入10 μL氨芐青霉素+50 μL β-內(nèi)酰胺酶、D加入10 μL氨芐青霉素+50 μL β-內(nèi)酰胺酶+50 μL舒巴坦），C與D抑菌圈差值三平行的均值為3.2 mm，樣品的C與D抑菌圈差值大于此值的均視為陽性。

本實驗室在國內(nèi)外的多種品牌的β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試劑盒的對比研究中發(fā)現(xiàn)，華安麥科及Charm品牌與參比方法所測定結(jié)果有較高的一致性，因此本次試驗選用這兩個品牌進行進一步研究。通過兩種快速檢測試劑盒對50批參比檢出限水平陽性樣品的檢測結(jié)果可知，兩種快速檢測試劑盒均無假陰性樣品出現(xiàn)，假陰性率均為0，說明兩種快速檢測試劑盒均具有良好的靈敏度。

為進一步考察兩種快速檢測試劑盒的特異性及一致性評價，在實際操作過程中對150批乳制品進行大批量篩查，檢測結(jié)果顯示所測定的液態(tài)乳和奶粉樣品中陽性樣品12批，陰性樣品138批，結(jié)果見表2。在本實驗選擇的兩種快速檢測試劑盒中，Charm試劑盒與杯碟法得出的結(jié)果無明顯差別，假陽性率僅為2%，且其標(biāo)稱檢出限水平與參比方法一致，均為4 U/mL，能滿足實際樣品檢測的需要，而華安麥科β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙條因其2～4 U/mL的檢出限則出現(xiàn)較多的陽性樣品，無法對假陽性率進行確證，但對于實際樣品的檢測有一定影響，并不利于大批量樣品測定的快速篩查工作。

表2 150批乳制品測定結(jié)果表

兩個品牌的β-內(nèi)酰胺酶快檢試劑盒部分檢測結(jié)果如圖1、圖2所示。Charm檢測試劑盒T線若比C線深則為陽性（＋），圖1中13批陰性樣品測定結(jié)果均為陰性（－）；華安麥科快速檢測試紙條T線若比C線深則為陽性（＋），T線若未出現(xiàn)則為失效（×），圖2中18批陰性樣品測定結(jié)果出現(xiàn)4批失效（×）及兩批假陽性（＋）。測定過程中發(fā)現(xiàn)，Charm檢測試劑盒對樣品的測定穩(wěn)定性較好，而華安麥科β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙條對于樣品的要求較高，常出現(xiàn)失效現(xiàn)象，需要重新測定驗證，因此綜上所述，選用Charm檢測試劑盒進行進一步定性方法性能指標(biāo)的確證。

圖1 Charm試劑盒部分檢測結(jié)果圖

圖2 華安麥科β-內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙條部分檢測結(jié)果圖

2.2 定性方法性能指標(biāo)的確證

相比于國產(chǎn)快速檢測試紙條，Charm試劑盒檢出限與國家標(biāo)準(zhǔn)一致，均為4 U/mL，且假陽性率僅為2%，在實際檢測中具備更高的實用性，因此選用Charm試劑盒的測定結(jié)果進行定性方法性能指標(biāo)的分析，Charm試劑盒與參比方法的150批乳制品測定結(jié)果通過統(tǒng)計學(xué)處理，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（卡方檢驗：x2=1.34，P＞0.05），根據(jù)評價方法，Charm試劑盒檢測β-內(nèi)酰胺酶的靈敏度為100%，特異性為97.8%，其靈敏度及特異性均達到試劑盒快速篩查檢測要求；與國家指定方法的符合率（即相對準(zhǔn)確度）為98%，Youden指數(shù)為0.978，說明Charm試劑盒與國家指定方法有較好的相關(guān)性和一致性，對于乳及乳制品的檢測能夠基本滿足大批量篩選的要求。

3 討論

國家指定方法杯碟法屬于微生物檢測方法，本方法對實驗操作者有較高要求，準(zhǔn)備工作較多，耗時較長，對于實驗條件要求嚴(yán)格。

Charm β-內(nèi)酰胺酶檢測試劑盒采用競爭性配體-受體免疫法，利用β-內(nèi)酰胺酶可分解乳及乳制品中的β-內(nèi)酰胺類抗生素的原理，通過快速測定與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)后殘留的青霉素G含量，從而快速檢測乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶殘留量。此試劑盒可快速檢測到牛奶樣品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶，靈敏度高，標(biāo)稱檢測限為4 U/mL，與國家指定方法杯碟法的要求一致，且檢出率無特異性差異，與國家指定方法的測定結(jié)果有較好的一致性，綜上所述，杯碟法和Charm檢測試劑盒法兩種檢測方法均可用于檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶含量，在實際檢測過程中，需要檢測大批量樣品時可根據(jù)實際情況選擇檢測方法，以近期食藥總局出臺的評價技術(shù)規(guī)范作為依據(jù)，填補了試劑盒評價的空白，提供了試劑盒法快速篩查的理論依據(jù)，可選用 Charm檢測試劑盒法作為快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法預(yù)先篩查大批量樣品，出現(xiàn)陽性樣品時需要采用杯蝶法進行進一步確證。

[1]梁 勇，李巧蘇.關(guān)于動物源食品安全性的思考[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（17）：295-296.

[2]買合木提·克衣木，宋迎春，買熱木尼沙·吾甫爾.無公害牛奶安全生產(chǎn)探析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（3）：239-240.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求[Z].2009.

[4]徐加勤，朱國紅.肺炎克雷伯菌AmpC酶和超光譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測及分析[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（10）：1817-1818.