吳 嫻，周湘紅，蘇 莉，安邦權，黃盛文

(1.貴州省臨床檢驗中心，貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院檢驗科，貴陽 550002； 3.貴州省人民醫(yī)院輸血科，貴陽 550002)

血友病A(hemophilia A，HA)是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷而引起的一種X-連鎖隱性遺傳性出血性疾病。由于FⅧ基因突變呈高度異質性，對HA患者及攜帶者只靠直接基因診斷，操作繁瑣、工作量大、耗時長、費用昂貴[1-2]，基于DNA多態(tài)性標志位點進行連鎖分析的間接基因診斷仍然是臨床上用于HA基因診斷的常用方法。常用于HA間接基因診斷的多態(tài)位點有BclⅠ、HindⅢ、St14(DXS52)和XbaⅠ等[3-5]，但每個位點的診斷率有限，并且在不同地區(qū)不同人群中的診斷率有所差異。為尋找新的可用于本地人群HA基因診斷的單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphism,SNP)，本文對FⅧ基因內5個亞洲人群中雜合度較高的SNP位點的多態(tài)性進行分析，并將在本地人群中具有多態(tài)性的位點用于HA家系的間接基因診斷，評價其對HA基因診斷的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 2012年6月至2014年10月，在貴州省人民醫(yī)院及貴州省血友病協(xié)會收集到16個無血緣關系的HA家系，家系成員共59名，先證者均為男性，年齡范圍5個月至45歲。根據HA診斷標準[6]，16例先證者中3例為重型，9例為中型，4例為輕型。另選取50例漢族健康女性用于SNP位點多態(tài)性分析，其年齡范圍21～59歲。

1.2方法

1.2.1SNP位點和酶切位點選取及引物設計 通過檢索UCSC數(shù)據庫(http://genome.ucsc.edu/)，按照在亞洲人群中雜合度較高且只具有二等位基因的條件篩選出5個SNP位點(rs1509787、rs1800291、rs3861554、rs1470586、rs6649625)。5個位點在FⅧ基因內的位置見圖1(圖中每1條豎線代表1個外顯子)。將SNP位點所在的DNA片段序列輸入WatCut在線軟件(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)確定酶切位點，并進行限制性內切酶的選擇。使用primer3.0在線軟件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計引物PCR引物(表1)。

圖1 5個SNP位點在FⅧ基因內的位置

1.2.2PCR擴增及酶切分析 5個SNP位點的PCR反應總體積為25 μL，反應體系包括：模板DNA 100 ng，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，dd H2O 8.5 μL。反應條件：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共 30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。酶切反應總體積為20 μL，包括10×buffer 2 μL，PCR產物 10 μL，限制性內切酶 2 μL，dd H2O 6 μL。樣品加好后，位點rs1509787、rs1800291、rs3861554、rs6649625置37 ℃水浴箱內酶解過夜。位點rs1470586置55 ℃水浴箱內酶解1 h。取10 μL酶切產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像觀察電泳結果。

表1 5個SNP位點信息及酶切分析

F：上游引物，R：下游引物

1.2.3測序驗證 用PCR-RFLP方法檢測50例健康女性標本，隨機選取各SNP位點不同基因型樣本各2例，將其PCR產物送上海生工生物技術有限公司進行測序，測序結果采用Chromas軟件進行分析，將測序結果與PCR-RFLP檢測結果進行比對。

1.2.4HA家系連鎖分析 選取在本地人群中具有多態(tài)性的SNP位點，檢測各家系成員的基因型。當先證者母親為多態(tài)位點的雜合型時，根據先證者及其母親的基因型，判斷出與致病基因連鎖的等位基因，據此對家系中的其他成員是否為患者或攜帶者做出診斷。

1.3統(tǒng)計學處理 采用的SPSS20.0軟件進行數(shù)據分析。計數(shù)資料采用率表示，通過直接計數(shù)對SNP位點基因型和等位基因頻率進行計算；采用χ2檢驗計算基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡；SNP位點多態(tài)信息量采用PIC-Calc6.0軟件(http://www.bbioo.com/download/58-247-1.html)計算。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.15個SNP位點多態(tài)性分析 50例健康女性中，rs1800291和rs6649625兩個位點均為純合型，其基因型分別為GG和TT；rs1509787、rs3861554、rs1470586 3個位點均具有多態(tài)性。其中，rs1509787檢出CC和CT兩種基因型，rs3861554檢出GG、AG和AA 3種基因型，rs1470586檢出GG、AG和AA 3種基因型。PCR-RFLP方法檢測結果與測序結果一致(圖2～4)。rs1509787、rs3861554、rs1470586位點的等位基因和基因型頻率見表2，等位基因和基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(P=0.651 7、0.775 9和0.780 0)。3個位點的雜合子頻率與UCSC數(shù)據庫提供的雜合子頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這3個SNP位點的多態(tài)信息量分別是0.106 4、0.344 4和0.310 8。

A：酶切電泳圖(M：5 000 bp DNA Marker；1、4：雜合子CT；2、3、4：純合子CC)；B：CC、CT基因型測序圖

圖2 rs1509787位點酶切后電泳圖及測序結果

A：酶切電泳圖(M：5 000 bp DNA Marker；11、16：純合子AA；12、14、15：純合子GG；13：雜合子AG)；B：AA、GG、AG基因型測序圖

圖3 rs3861554位點酶切后電泳圖及測序結果

A：酶切電泳圖(M：5 000 bp DNA Marker；1、4：純合子AA；3：純合子GG；2、5、6：雜合子AG)；B:AA、GG、AG基因型測序圖

圖4 rs1470586位點酶切后電泳圖及測序結果

2.23個SNP位點用于HA家系的間接基因診斷

表2 rs1509787、rs3861554和rs1470586位點等位基因及基因型頻率

3個SNP位點可對16個家系中的7個家系做出間接基因診斷，家系的診斷率為43.8%。rs1509787可為2個家系提供診斷信息，rs3861554可為5個家系提供診斷信息，rs1470586可為1個家系提供診斷信息，家系診斷率分別為12.5%、31.5%和6.25%。其中，有1個家系可同時由rs1509787和rs1470586提供診斷信息。

3 討 論

利用FⅧ基因內和基因外的DNA多態(tài)性標記對HA進行間接基因診斷具有簡便、價廉的優(yōu)點，但同一位點在不同的文獻報道中診斷率差異較大。BclⅠ對中國人的HA診斷率為27.8%～50%[4,7]，國外文獻報道的診斷率為46.3%[8]。HindⅢ對中國人的HA診斷率為37.5%[4]，在北印度人群中的雜合率為38%[9]。Stl4(DXS52)的診斷率相對較高，可達70%以上[10]，但該位點與FⅧ基因的相對距離為2cM，有2%的重組可能。本課題組對16個血友病A家系的研究表明，BclⅠ和Stl4(DXS52)對HA的診斷率分別為12.5%和25.0%，而HindⅢ未能提供診斷信息[11]，與文獻報道有較大差異。因此，有必要尋找新的適合于本地人群的多態(tài)位點用于HA間接基因診斷[12]。

本研究結果顯示5個FⅧ基因內的SNP位點中，rs1800291及rs6649625均為純合型，與UCSC數(shù)據庫提供的數(shù)據不相符，這說明不同地區(qū)和人群的多態(tài)位點雜合度會有所不同。因此，對所選人群而言，這兩個位點不具有診斷價值。rs1509787、rs3861554及rs1470586均具有多態(tài)性，測序結果與PCR-RFLP方法檢測結果一致。3個位點的等位基因及基因型頻率與UCSC數(shù)據庫提供的數(shù)據比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，多態(tài)信息量分別為0.106 4、0.344 4、0.310 8。

本研究檢測的16個家系中有7個家系可利用這3個具有多態(tài)性的SNP位點提供診斷信息，總的家系的診斷率為43.75%(7/16)，其中有5個家系可以用rs3861554位點提供診斷信息，2個家系可以用rs1509787位點提供診斷信息，1個家系可以用rs1470586位點提供診斷信息。因此，本研究所選的3個SNP位點具有臨床診斷價值，尤其是rs3861554的多態(tài)信息量較大，診斷率較高，可作為本地人群HA診斷的常用多態(tài)位點。這3個位點是否對其他人群具有診斷價值，還需要作進一步的驗證。聯(lián)合運用上述幾個多態(tài)位點仍有部分家系不能做出診斷，還需要繼續(xù)尋找更多適合于本地人群HA診斷的多態(tài)位點。

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