趙文忠，羅招凡,傅文婷,吳瑞珊,鐘 安,周 雨

(1.廣東省計劃生育科學技術(shù)研究所國家衛(wèi)計委男性生殖與遺傳重點實驗室，廣州510600； 2.中山大學附屬第七醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518017)

全世界約15%的育齡夫婦存在不育問題，其中男性因素導致的不育約占50%[1]。非阻塞性無精癥是最常見的男性不育癥類型，成年男性發(fā)病率約為 1%。在各種影響男性不育的因素中，遺傳因素是導致不育的重要原因，有15%～30%的男性不育癥是由遺傳性因素引起的。目前研究較多的包括染色體異常、Y染色體微缺失及不育相關(guān)基因的突變和遺傳多態(tài)性[2]。表觀遺傳學是研究DNA序列未發(fā)生變化但表型卻發(fā)生可遺傳改變的一門學科，其主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控等幾個方面，表觀遺傳修飾在精子發(fā)生及受精過程中都起著非常重要的作用[3]。miRNA是一類可調(diào)節(jié)基因表達、調(diào)節(jié)生長發(fā)育、維持機體正常生理功能的重要非編碼RNA。越來越多的研究表明， miRNA對于正常精子發(fā)生是必要的[4]。在本研究中，筆者選用 miRNA 表達譜的寡核苷酸芯片，利用其快速、平行、高通量的檢測特點，對比分析了非阻塞性無精癥患者和正常捐精者血清 miRNA 的表達水平，為進一步研究 miRNA 在非阻塞性無精癥中的作用機制提供了堅實的基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 非阻塞性無精癥患者血清樣品來源于廣東省計劃生育?？漆t(yī)院，經(jīng)男科確診為非阻塞性無精癥患者；對照組為廣東省人類精子庫捐精且符合供精條件的健康男性血清標本。非阻塞性無精癥診斷標準為在排除輸精管道梗阻因素外，精液常規(guī)分析兩次未發(fā)現(xiàn)精子的無精癥。標本采集前經(jīng)廣東省計劃生育?？苽惱砦瘑T會同意，患者知情同意后進行。

1.2試劑 總RNA提取試劑為ThermoFisher公司的TRIzol；RNA純化試劑為QIAGEN公司的miRNeasy mini kit；miRNA標記試劑為Exiqon公司的miRCURYTM Array Power Labeling kit；miRNA 表達譜的寡核苷酸芯片為Exiqon公司的miRCURYTM Array。

1.3方法

1.3.1血清采集 采集2 mL空腹外周血置于無抗凝劑試管中，室溫放置30～60 min，使血液凝固，將上層血清小心轉(zhuǎn)移到收集管中，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2RNA提取 取2例非阻塞性無精癥患者血清和2例正常捐精者血清，采用試劑TRIzol提取血清總RNA，按照試劑miRNeasy mini kit說明書純化RNA。然后，采用分光光度計NanoDrop ND-1000 檢測RNA的量和純度。

1.3.3miRNA標記 采用Exiqon公司的miRCURYTM Array PowerLabeling kit，按照操作說明書進行標記。

1.3.4miRNA芯片雜交 采用 miRCURYTM Array (16.0)試劑盒進行雜交， 于56 ℃雜交16～20 h，芯片在室溫條件下晾干，分別用不同的緩沖液清洗2 min，1 000 r/min離心5 min ，待芯片干燥后立即掃描。

1.3.5miRNA芯片圖像采集和分析 采用Axon GenePix 4000B microarray scanner掃描，GenePix proV6.0處理原始圖像。用原始信號值減去該點的前景值得到每個探針的修正值，選取本次實驗中在芯片修正值均大于或等于50的非對照探針，將這部分探針的修正值統(tǒng)計處理后，取其中值作為基準，對整張芯片的點做標準化處理。以Fold change不低于1.5，P值不低于0.05的標準來篩選差異表達的miRNA，并進行聚類分析。

1.3.6實時定量PCR驗證 根據(jù)miRNA 微陣列芯片結(jié)果，選取5個Fold change較高的miRNA，采用 Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR?Kit進行實時定量PCR驗證。取1.3.2提取RNA 2 μg，采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄引物為5′-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC GGC ATG ACA GTG-3′;以5S rRNA為內(nèi)參基因。 其他按照試劑盒說明進行。本試驗所采用的上游引物hsa-miR-483-3p：5′-ACT CCT CTC CTC CCG TCT T-3′；hsa-miR-194-3p：5′-AGT GGG GCT GCT GTT ATC TG-3′；hsa-miR-4275：5′-GCC CCA ATT ACC ACT TCT TTA-3′；hsa-miR-221-5p：5′-ACC TGG CAT ACA ATG TAG ATT T-3′；hsa-miR-1263：5′-TAC CCT GGC ATA CTG AGT AAA-3′；5S rRNA：5′-GTC TAC GGC CAT ACC ACC CTG AAC-3′。下游引物采用試劑盒中的3′引物:5′-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AA-3′。反應在96孔STEPONEPLUS(美國ABI)熒光PCR儀上進行擴增,每組設(shè)3個復孔。反應條件為:94 ℃預變性 10 s；94 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。反應結(jié)束由計算機自動計算得到各反應管循環(huán)閾值(threshold cycle,Ct),采用2-ΔΔCt法對基因表達進行相對定量分析。

1.3.7靶基因預測 采用3種在線軟件 (miRBase Targets、TargetScan、DIANA-microT)對相應的 miRNA靶基因進行預測。

2 結(jié) 果

2.1RNA純度與質(zhì)量 分離的血清RNAOD260/280>1.7，質(zhì)量大于10 ng，符合芯片分析的要求，純度與質(zhì)量分析見表1。

表1 NanoDrop ND-1000測定RNA質(zhì)量

圖1 非阻塞性無精癥患者和正常捐精者

2.2非阻塞性無精癥患者和正常捐精者血清中差異表達的miRNA 非阻塞性無精癥患者和正常捐精者血清miRNAs表達微陣列經(jīng)掃描和數(shù)據(jù)分析，共篩選出71個差異表達的miRNAs(圖1、2)，包括47個表達上調(diào)的 miRNAs和24個表達下調(diào)的 miRNAs，見表3、4。

圖2 非阻塞性無精癥患者和正常捐精者血清中miRNA 表達譜聚類分析結(jié)果

ID名稱差異倍數(shù)ID名稱差異倍數(shù)42696hsa-miR-9431.78842403142446hsa-miR-576-5p3.141600673147900hsv2-miR-H62.05432993646479hsa-miR-1304-5p2.08217286148493hsa-miR-3613-3p1.56287743146096hsa-miR-7642.96925898811260hsa-miR-151a-5p1.543682658148597hsa-miR-3663-5p2.35763256517289hsa-miR-616-5p1.822142616147915hsa-miR-31742.751212606146124hsa-miR-4796-3p2.06393505130908hsa-miRPlus-C10561.67433071817358ebv-miR-BART162.2958661917566hsa-miR-629-3p1.59453853314301hsa-miR-361-5p7.278690277147920hsa-miR-42902.19912746827740hsa-miR-574-5p2.161862253147556hsa-miR-42543.563802173147706hsa-miR-42551.901529813147975hsa-miRPlus-J10031.550063511147821hsa-miR-31691.664542042148481hsa-miR-36462.588754939147836hsv2-miR-H7-5p3.079757465148349hsa-miR-39381.567970741148682hsa-miR-483-3p8.66084117227544hsa-miR-363-5p1.82968224515619hsa-miR-6492.146745882148307hsa-miR-36121.741334801

續(xù)表3 上調(diào)的 miRNAs

表4 下調(diào)的 miRNAs

表5 受miRN調(diào)節(jié)的潛在靶基因

2.3差異表達miRNA的實時定量PCR驗證結(jié)果 將芯片結(jié)果與實時定量PCR結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示在非阻塞性無精癥患者和正常捐精者血清中 hsa-miR-483-3p、hsa-miR-194-3p、hsa-miR-4275表達增加，而hsa-miR-221-5p、hsa-miR-1263 表達降低，芯片與實時定量PCR檢測到的差異miRNA表達一致，說明本研究芯片結(jié)果真實可靠，見圖3。

2.4靶基因預測結(jié)果 采用3種在線軟件(miRBase Targets、TargetScan、DIANA-microT)對相應的miRNA靶基因進行預測，可能的靶基因均與生精功能有關(guān)，見表5。

圖3 定量 RQ-PCR 與芯片雜交結(jié)果比較

3 討 論

miRNA廣泛存在于各條染色體中，這些miRNA雖然只占人類基因總數(shù)的2%，卻調(diào)控著人類全基因組中30%以上基因的表達。在哺乳動物細胞中，大多數(shù)miRNA是由基因間DNA序列編碼，也有部分miRNA是由位于基因內(nèi)含子的DNA序列編碼。每個miRNA可能有多個靶基因，而多個miRNAs可調(diào)節(jié)同一個基因[5]。目前在人類細胞發(fā)現(xiàn)的miRNA共有上千種，人體內(nèi)不同器官組織都具有各自獨特的miRNA表達譜，miRNA在血液和尿液等體液中穩(wěn)定存在，并與組織中的 miRNA相關(guān)，分析 miRNA在血液中的表達，能夠了解機體組織狀況，血清miRNA的表達改變能預示疾病的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)歸[6]。在本研究中，采用miRCURYTM Array (v16.0)表達譜芯片，分析非阻塞性無精癥患者和正常捐精者血清miRNAs，共篩選出71個差異表達的 miRNAs，包括 47個表達上調(diào)的miRNAs和24個表達下調(diào)的miRNAs。目前尚無法預知這些表達差異的miRNA中，哪些對精子生成有影響。在后續(xù)實驗中，筆者將在增加樣本量的基礎(chǔ)上，進一步檢測睪丸組織的miRNA表達，闡明這些miRNA在精子生成的作用和功能。

已有研究表明，miRNAs廣泛參與精子發(fā)生的過程[4]。 BJORK等[7]研究表明，miR-18a可直接作用于熱休克因子2(heat shock factor 2，HSF2)，來控制精子發(fā)生過程中必需的基因的表達。LIAN等[8]研究顯示，miR-383通過pRb信號通路使IRF1轉(zhuǎn)錄增強,導致精子生成受阻。LIU等[9]研究表明，miR-122可以通過調(diào)節(jié)TNP2的表達，從而影響精子正常形態(tài)的發(fā)育。MORITOKI等[10]發(fā)現(xiàn)MiR-135a有助于維持精原干細胞。YUAN等[11]研究表明，兩個功能相關(guān)的miR-34b/c和miR-449a/b/c簇對于精子發(fā)生是必須的。筆者通過在線分析軟件發(fā)現(xiàn),差異性表達的miRNA 的潛在靶基因都與精子生成有關(guān)。hsa-miR-1263與精子特異的硫氧還蛋白域有關(guān)，hsa-miR-194-3p與DAZ基因有關(guān)，hsa-miR-221-5p與精子生成有關(guān)；hsa-miR-483-3p的潛在靶基因是SRY基因。

筆者分析了非阻塞性無精癥患者和正常捐精者血清中 miRNA 表達,發(fā)現(xiàn)了多個存在顯著差異性表達的 miRNA,并進行了初步驗證及靶基因預測，為進一步研究 miRNA 與非阻塞性無精癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供了新的線索。

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