趙 明 閆 雷 龔守良 隋汝波

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of neurotoxicity mediated byβ-amyloid protein 42(Aβ42) on expressions of cerebellar AMPA receptor (AMPAR) GluR2 subunit and caspase-3 protein and gene.MethodsAlzheimer′s disease (AD) animal model was prepared by intracerebroventricular injection of Aβ42 (5 μl), and water maze test was used to screen and enroll SD rats. Samples were randomly divided into control (intracerebroventricular injection of 5 μl saline) and Aβ42 intracerebroventricular injection group, and the expressions of GluR2 subunit, caspase-3 protein and gene of cerebellum AMPAR were detected by immunohistochemical staining, Western blot and RT-PCR.ResultsThe expressions of GluR2 subunit gene and protein in the Aβ42 intracerebroventricular injection group were significantly lower than those of control group (P<0.05). while the expression of caspase-3 was significantly higher than that of control group (P<0.05), and the results of Western blot were consistent with the results of RT-PCR.ConclusionsNeurotoxicity mediated by Aβ42 affects the expressions of GluR2 subunits and caspase-3 in cerebellar AMPAR, and AMPAR participates in the neurotoxicity mediated by Aβ42 in the cerebellum of rats with AD via caspase-3.

【Keywords】 Alzheimer′s disease; β-amyloid 42 (Aβ42); Cerebellum; AMPAR; Caspase-3

有研究顯示，小腦作為神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，不僅在運(yùn)動(dòng)方面起作用，其在認(rèn)知功能、自主神經(jīng)系統(tǒng)及邊緣系統(tǒng)中同樣起重要作用〔1〕。學(xué)習(xí)記憶能力受多種因素調(diào)控，目前關(guān)于突觸可塑性及神經(jīng)遞質(zhì)的研究較多，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD)是兩種主要類型的突觸可塑性功能〔2〕。小腦浦肯野細(xì)胞層高表達(dá)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體(AMPAR)〔3〕，而AMPAR誘導(dǎo)LTP/LTD的形成是學(xué)習(xí)記憶的重要模型〔4〕。AMPAR是由4種不同基因編碼的亞基組成，即谷氨酸受體(GluR)1、2、3和4，其中GluR2亞基由于其mRNA Q/R位點(diǎn)編輯引起的低Ca2+通透性，使其在AMPAR中的相對(duì)含量決定了AMPAR的功能特性。β-淀粉樣蛋白(Aβ)由39 ～ 43個(gè)氨基酸組成，其二聚體是最小的突觸毒性物質(zhì)，是引起阿爾茨海默病(AD)的重要物質(zhì)。Aβ可被蛋白酶作用而分解為氨基酸的殘基亞型，其中最常見的是Aβ40和Aβ42，后者與AD病情相關(guān)。本研究探討Aβ42介導(dǎo)的AD對(duì)小腦AMPAR的GluR2亞基及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是由中國(guó)北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠24只，體重220～260 g，隨機(jī)分為對(duì)照組和Aβ42組。許可證號(hào)：SCXK(京)NO11400700058126。

1.2造模方法 Aβ42組每隔1 d給予80 μmol/L Aβ42 5 μl側(cè)腦室注射；對(duì)照組每隔1 d側(cè)腦室注射5 μl生理鹽水。17 d后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，取實(shí)驗(yàn)樣品。

1.3主要試劑和儀器 鼠抗GluR2抗體(Sigma P-246)、鼠抗caspase-3抗體(NOVUS NB600-1372)和鼠抗肌動(dòng)蛋白(actin)抗體(Abcam ab18570)等試劑；倒置顯微鏡(德國(guó) Leica，4 000 b)；雙 臂 小 動(dòng) 物 腦 立 體 定 位 儀 ( 美 國(guó) Stoelting，51903)；全自動(dòng)熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP，Bio Spectrum 510)。

1.4Morris水迷宮測(cè)試 在水迷宮的采集培訓(xùn)期間，要求大鼠連續(xù)5 d找到一個(gè)隱藏平臺(tái)，第6～8天評(píng)估空間學(xué)習(xí)能力。同時(shí)測(cè)定大鼠到達(dá)平臺(tái)的有效路徑。

1.5腦組織取材 每組中任選3只大鼠于10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，用4%多聚甲醛緩沖液灌流固定48 h以上，小腦經(jīng)30%蔗糖沉降48 h后，用冰凍切片機(jī)制備18 μm腦組織切片，置于含1%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS)中4℃保存。用于免疫熒光染色。 分別隨機(jī)選擇3只大鼠，麻醉后直接斷頭解剖，收集小腦組織于EP管中，置于-80℃保存，用于Western印跡檢測(cè)和PCR檢測(cè)。

1.6Western印跡 組織蛋白提取，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒蛋白定量，根據(jù)所需蛋白分子量大小配制適宜濃度十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離膠和濃縮膠，起始加樣孔加5倍重懸緩沖液(RSB)5 μl，按順序向加樣孔中逐個(gè)加入20 μl蛋白樣品，剩余空泳道加入5 μl RSB，電泳，轉(zhuǎn)膜，GluR2、caspase-3抗體孵育，增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯像。

1.7免疫組化熒光顯色 進(jìn)行小腦冰凍切片(18 μm)，羊血清封閉1 h；Ⅰ 抗：鼠抗GluR2抗體(Sigma P-246)(1∶1 000)；Ⅱ抗：兔抗鼠免疫球蛋白(Ig)G，常規(guī)PBS沖洗5 min，共3次，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min，甘油封片并鏡檢。

1.8RT-PCR 將裝有組織的EP管至于冰上，向每個(gè)EP管中加入1 ml Trizol，混勻，用超聲波破碎儀打碎后，冰浴條件靜止10 min，各加入氯仿0.2 ml，搖勻，冰浴條件靜止10 min，4℃離心15 min，12 000 r/min，取上清液至另一已標(biāo)記好的EP管中，加入0.5 ml異丙醇，混勻，冰浴條件靜止10 min，4℃離心10 min 12 000 r/min，棄上清液后75%乙醇1 ml洗滌，4℃離心機(jī)7 500 r/min離心5 min棄上清液。自然風(fēng)干5 min。取適量DEPC水加入EP管，溶解RNA，測(cè)定RNA樣品濃度。設(shè)計(jì)引物，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增，上樣、電泳，顯像及條帶分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS19.0軟件行配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠逃避潛伏期及有效路徑情況比較 連續(xù)5 d的訓(xùn)練大鼠找到隱藏的平臺(tái)的時(shí)間逐漸縮短，有效路徑顯著增高。第6～8天，Aβ42組大鼠穿過平臺(tái)次數(shù)百分比〔(24.48±0.29)%〕較對(duì)照組〔(32.45±0.48)%〕明顯降低(P<0.05)；Aβ42組穿過平臺(tái)次數(shù)〔(2.45±0.23)次〕較對(duì)照組〔(4.32±0.56)次〕明顯減少(P<0.05)。

2.2兩組GluR2和caspase-3蛋白表達(dá)情況比較 Aβ42組GluR2亞基表達(dá)水平(0.76 ± 0.80)較對(duì)照組(1.03 ± 0.13)明顯減少(P<0.01)。Aβ42組caspase-3表達(dá)水平(0.63 ± 0.08)較對(duì)照組(0.55 ± 0.78)明顯增高(P<0.05)。見圖1。

2.3兩組GluR2亞基免疫熒光檢測(cè)比較 Aβ42組GluR2(8.59±0.88)較對(duì)照組(15.53±0.87)表達(dá)明顯減少(P<0.05)。見圖2。

2.4兩組GluR2、caspase-3基因表達(dá)比較 Aβ42組GluR2基因表達(dá)量(1.14 ± 0.18)較對(duì)照組(1.55 ± 0.07)顯著減少(P<0.01)。Aβ42組caspase-3基因表達(dá)量(0.58 ± 0.11)較對(duì)照組(0.43 ± 0.09)顯著增加(P<0.05)。見圖3。

圖1 兩組GluR2和caspase-3蛋白表達(dá)

圖2 兩組GluR2免疫組化熒光顯色

圖3 兩組GluR2和caspase-3基因表達(dá)

3 討 論

既往小腦被認(rèn)為AD不被累及的腦組織區(qū)域，且在影像學(xué)上被作為對(duì)照研究。近年來的研究及PET的應(yīng)用進(jìn)一步證實(shí)小腦并不能作為AD患者的腦組織參考區(qū)域〔5〕。也有研究發(fā)現(xiàn)，電刺激小腦頂核可改善Aβ42誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙〔6〕。Hu等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，具有促進(jìn)Aβ形成作用的mRNA亞型FE65，在AD患者小腦上表達(dá)上調(diào)。由此有理由推斷小腦參與了AD病程。

AMPAR是由四聚體構(gòu)成的離子通道受體，與NMDAR和KAR介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞〔8〕。AMPAR介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)快速興奮性突觸傳遞，在突觸后膜的動(dòng)態(tài)表達(dá)與LTP和LTD的誘發(fā)和維持有關(guān)，參與調(diào)解學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)〔9〕。在小腦中，LTD的形成是由于GluR2亞基磷酸化作用導(dǎo)致受體內(nèi)化，LTP 的形成是由于GluR2的脫磷酸化作用，使GluR2亞基表達(dá)于細(xì)胞膜表面〔10〕。此外，大部分AMPAR對(duì)Ca2+不通透，因?yàn)樗木垠w中含有GluR2亞基受體，然而缺乏GluR2亞基可致Ca2+通透，調(diào)節(jié)突觸可塑性甚至介導(dǎo)神經(jīng)毒性〔11〕。本實(shí)驗(yàn)中，Aβ42組GluR2亞基表達(dá)量下降可能與GluR2亞基磷酸化導(dǎo)致受體內(nèi)化有關(guān)，而擾亂GluR2亞基的插入和胞吞可致突觸可塑性機(jī)制受損及LTP/LTD等突觸可塑性事件發(fā)生異常，這與AD早期認(rèn)知功能障礙存在緊密聯(lián)系。另一方面，含GluR2亞基的AMPAR減少，可導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，導(dǎo)致鈣超載。研究表明，AD屬于一種多因素疾病，涉及多種病理機(jī)制，最終形成凋亡理論〔12〕。D′Amelio等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，caspase-3可早期導(dǎo)致AD小鼠突觸功能喪失。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ42組小腦中caspase-3蛋白及基因表達(dá)較對(duì)照組增高，其可能機(jī)制是GluR2亞基下調(diào)導(dǎo)致鈣超載。然而，caspase-3是否進(jìn)一步誘導(dǎo)AMPAR的GluR2亞基表達(dá)量下降有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果主要是在組織水平獲取的，后期實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步行細(xì)胞研究及對(duì)GluR2亞基磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)小腦進(jìn)行形態(tài)學(xué)監(jiān)測(cè)可更加明確這一觀點(diǎn)。

綜上，本結(jié)果表明，側(cè)腦室注射Aβ可成功制造AD大鼠模型。AMPAR的GluR2亞基可通過改變AD大鼠小腦LTP/LTD形成導(dǎo)致小腦突觸可塑性發(fā)生變化，從而對(duì)學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生影響。GluR2亞基下調(diào)的同時(shí)導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，可產(chǎn)生神經(jīng)毒性，進(jìn)一步證實(shí)小腦參與了AD病程。

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