1.引言

大腸埃希氏菌俗稱大腸桿菌，是人類和動物的腸道中重要的正常菌群，為宿主提供一些有營養(yǎng)作用的合成代謝產(chǎn)物。多數(shù)大腸埃希氏菌并不致病，當機體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時，可作為條件致病菌而引起腸道外的感染，引起胃腸炎的大腸埃希氏菌分為五類即腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EⅠEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)和粘附性腸埃希氏菌(EAEC)[1]?？焖贆z測和鑒定病原菌是及時有效地控制與預防傳染病傳播的重要手段。傳統(tǒng)的微生物學分離與鑒定以及血清學方法在鑒別與鑒定病原微生物方面日益顯現(xiàn)出不足。PCR法快速、敏感、特異，是對病原菌快速鑒別與分型的重要技術之一，而多重PCR更以其突出的優(yōu)越性得到了廣泛的應用[2]。

2.材料與方法

2.1 樣品

樣品編號為15-1, 15-2，每份考核樣品包含西林瓶1個，西林瓶中裝有白色凍干菌球。本次考核共計2份樣品。

2.2 試劑及儀器

營養(yǎng)肉湯、腸道菌增菌肉湯、麥康凱瓊脂(MAC)、伊紅美藍瓊脂(EMB)、三糖鐵(TSⅠ)瓊脂、大腸埃希氏菌生化套盒、無菌雙蒸水，以上試劑均使用北京路橋。五種致瀉大腸埃希氏菌DNA提取試劑盒、多重PCR及實時熒光PCR試劑盒均使用北京卓誠惠生，實時定量PCR儀器（BⅠO-RAD公司），凝膠成像儀（BⅠO-RAD公司），電泳儀。

2.3 試驗方法

按照GB4789.6-2016《食品安全國家標準 食品微生物學 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[2]開始檢測。

2.3.1 樣品前處理與預增菌

待質控樣品恢復至室溫，無菌開啟瓶蓋，將西林瓶中的白色菌球完全溶解于50mL無菌生理鹽水中,作為樣本。

2.3.2 以無菌操作量取檢樣25mL，加入裝有225mL營養(yǎng)肉湯的無菌袋中，振蕩混勻。將營養(yǎng)肉湯增菌液放置于36℃培養(yǎng)18h（增菌時間延長）。取1mL（加樣量增大）,接種于30mL腸道菌增菌肉湯管內，于42℃培養(yǎng)18h。

2.3.3 分離

將增菌液劃線接種MAC和EMB瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)24h，觀察菌落特征。

2.3.4 生化鑒定

選取平板上10個可疑菌落,分別接種TSⅠ斜面。同時將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、尿素瓊脂(pH7.2)、KCN肉湯和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)24h。

2.3.5 PCR確證試驗

使用1μL接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落，懸浮于200μL滅菌雙蒸水中，充分打散制成菌懸液，13000r/min離心3min，棄掉上清液。加入50μL充分震蕩混勻的核酸提取液，于100℃金屬浴維持10min，13000r/min離心3min，收集上清液，取2μL作為PCR檢測的模板。

3.結果與分析

3.1 平板分離結果結果如下

編號 麥康凱（MAC）培養(yǎng)基 伊紅美藍（EMB）15-1 桃紅色、濕潤、圓形菌落；淡粉色、濕潤、圓形菌落中心紫黑色帶金屬光澤;部分中心紫黑色不帶金屬光澤15-2 桃紅色、濕潤、圓形菌落；淡粉色、濕潤、圓形菌落中心紫黑色帶金屬光澤;部分中心紫黑色不帶金屬光澤

3.2 可疑菌落生化鑒定結果如下

注：“-”表示無生長，“+”表示生長。10個可疑菌落生化結果相同。

3.3 可疑菌落PCR確證試驗結果如下

注：“-”表示無條帶或曲線，“+”表示有條帶或曲線。

4.討論與分析

本實驗室自2014起，參與國家食品風險監(jiān)測項目，并開始使用多重PCR技術，對五種致瀉大腸埃希氏菌進行檢測。GB4789.6-2016自2017年6月23日執(zhí)行以來，也是食品微生物學檢驗系列國標中，首個細菌使用PCR做確證的標準。河南省疾病預防控制中心對全省各地市進行了質控考核，了解各實驗室對該技術掌握的程度以及實驗室檢測水平。

傳統(tǒng)的血清學分型，操作繁瑣，技術人員要求高，且檢驗結果并不能作為是否有致病能力的依據(jù)，只能說某個血清型可能與致病相關。血清學鑒定的137株致瀉大腸中僅有15株（10.9%）為正確鑒定，僅采用血清學分類是不夠的[3]。與傳統(tǒng)血清試驗相比較而言，用PCR方法進行確證，操作簡單，對操作人員要求不高，且提高致病菌檢出率及檢驗的準確性，同時縮短了致病菌的檢驗時間。隨著快速檢驗方法的發(fā)展，快速檢驗因其優(yōu)點快速發(fā)展，在突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處理中，發(fā)揮積極作用，但快速方法也存在其缺點，快速檢驗一般從基因著手，檢測到致病菌并未獲得其菌株，容易產(chǎn)生假陽性結果。因此，在面對突發(fā)公共衛(wèi)生事件時，應該靈活運用，將快檢方法與傳統(tǒng)方法相結合，快速準確地得出實驗室結果，為相關部門處理問題提供可靠依據(jù)。該實驗室在此質控過程中使用了兩種多重PCR方法來進行確證試驗，相互印證結果，兩種方法實驗結果一致。實時熒光多重PCR優(yōu)點在于將PCR擴增與結果判定結合一起，操作簡單，耗時短，污染少。普通PCR試驗后，需要進行電泳試驗并用凝膠成像儀觀察結果，操作繁瑣，試驗過程耗時長，存在污染環(huán)境風險[4]。

[1] 李凡, 劉晶星. 醫(yī)學微生物學(第七版)[M]. 北京∶人民衛(wèi)生出版社, 2012.

[2] 世界衛(wèi)生組織. 麻疹實況報道. 2017－03.

[3] GB4789.6-2016《食品安全國家標準 食品微生物學 致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗》[s].

[4] J Yang ,FJWu, J Mu,L Lin ,et al.Comparison between O Serotyping Method and Multiplex Real-Time PCR To Ⅰdentify Diarrheagenic Escherichia coli inTaiWan [J].《Journal of Clinical Microbiology》, 2007, 45(11) ∶3620-3625