鄭小君,王 琦,陸 鑫,傅正偉,倪銀華

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,中國浙江杭州310014)

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快,熬夜、飲食不規(guī)律等陋習(xí)逐漸成為常態(tài),而這些陋習(xí)將導(dǎo)致一系列不良后果,如引起生理功能紊亂及各種代謝相關(guān)疾病等。研究顯示,這些病癥與生物鐘紊亂存在著密不可分的聯(lián)系[1]。生物鐘受到日出日落、運動休息、飲食習(xí)慣、社交活動等因素影響,這些能夠外源調(diào)節(jié)生物鐘的因素稱之為授時因子(Zeitgebertime,ZT)[2]。近年來,通過飲食習(xí)慣尤其是食物信號對生物鐘進(jìn)行調(diào)控成為人們的研究熱點。國內(nèi)外已有多項研究發(fā)現(xiàn)食物信號刺激不僅僅能夠顯著地影響子鐘的節(jié)律,而且能在一定程度上誘導(dǎo)子鐘脫離母鐘的控制,甚至可能直接影響母鐘的節(jié)律[3,4]。

白蘭氏蟲草雞精(Brand’s Essence of Chicken with Cordyceps,BECC)富含蛋白質(zhì)、多肽、人體所需的必需氨基酸和多種礦物質(zhì)。經(jīng)過成分分析,BECC含有L-肌肽(L-carnosine)、鵝肌肽(anserine)和?；撬岬葼I養(yǎng)元素,長久以來被人們用作補充營養(yǎng)、增強體質(zhì)的補益食品[5]。此外,BECC中還含有中國民間慣用的一種名貴滋補藥材——冬蟲夏草,它可入藥,也可食用,是上乘的佳肴,具有很高的營養(yǎng)價值[6]。冬蟲夏草含有不飽和脂肪酸、蟲草酸、糖類脂肪、維生素B12、麥角脂醇、六碳糖醇和生物堿等多種營養(yǎng)成分,對人體有多種保健功能[7,8]。

為了研究BECC對哺乳動物生物鐘系統(tǒng)的影響,我們通過構(gòu)建短期顛倒光周期(打亂其生物節(jié)律),同時外源補充BECC的大鼠模型,從生理水平和基因轉(zhuǎn)錄水平,探究BECC對大鼠外周生物鐘的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

250 g左右的雄性Wistar大鼠,由中國科學(xué)院上海實驗動物研究中心提供。實驗動物飼養(yǎng)在嚴(yán)格控制的人工模擬晝夜循環(huán)的環(huán)境中,光暗周期為12 h∶12 h,光源為日光燈,強度為200 lx,溫度控制在22±1℃,自由飲水。在正常光周期下,將自然時間轉(zhuǎn)換為授時因子,光照起點時間定為ZT0,光照結(jié)束時間定為ZT12,其余點按照對應(yīng)的ZT時間點轉(zhuǎn)換。實驗大鼠在正常光周期條件下飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境,自由飲水但限制在暗期的12 h內(nèi)攝食。實驗大鼠在正式實驗之前均為適應(yīng)期,自由飲食飲水,基礎(chǔ)飼料飼喂?；A(chǔ)飼料由中國科學(xué)院上海實驗動物研究中心提供。

1.2 實驗飼料及攝入量

BECC由新加坡(太平洋)食益補有限公司提供,每瓶68 mL,經(jīng)凍干后為黃色粉末,約每瓶6 g,按照7.5%(質(zhì)量比)的比例混合至基礎(chǔ)飼料。在暗點給予飼料時,Control組給予足量的基礎(chǔ)飼料,而BECC組給予含BECC的1 g飼料以及足量的基礎(chǔ)飼料,BECC的攝入量為每只大鼠每天0.075 g。確保飼料在2 h內(nèi)耗盡后,繼續(xù)添加基礎(chǔ)飼料供應(yīng)小鼠夜間進(jìn)食所需。

1.3 實驗設(shè)計

實驗設(shè)計如圖1所示。大鼠隨機均分成3組:1)Control組(30只)。正常光照周期,暗期喂食基礎(chǔ)飼料;2)Normal組(60只)。正常光周期,暗期喂食基礎(chǔ)飼料;3)BECC組(60只)。正常光周期,暗期喂食1 g含BECC的飼料以及足量的基礎(chǔ)飼料。連續(xù)飼養(yǎng)2周后,Control組大鼠在正常光周期條件下,自ZT0起,每個時間點解剖5只大鼠,共計6個時間點,時間間隔為4 h。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后,頸動脈取血并取得肝臟和心臟等外周組織,迅速冷凍于液氮中,轉(zhuǎn)而保存至-80℃冰箱中備用。Normal組和BECC組通過延長光照時間顛倒光周期,在顛倒光周期后的第3 d及第5 d,自ZT0起,每隔4 h,共計6個時間點,每個時間點解剖5只大鼠,保存血清及肝臟和心臟等外周組織。大鼠飼養(yǎng)全程監(jiān)測其行為活動。

圖1 實驗設(shè)計圖Fig.1 Experimental design chart

1.4 RNA的提取與濃度測定

用TRIZOL Reagent(Takara公司,Japan)提取心臟以及肝臟中總RNA(按說明書步驟操作)。用超微量紫外可見分光光度計(Ultrospec 4300 pro,Sweden)測定在260 nm與280 nm波長下的光密度值,得到RNA濃度。

1.5 反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR分析

RNA樣本解凍混勻后,65℃預(yù)變性5 min,然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司,Japan)說明書操作。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系組成:2 μL ExScript buffer(5×);0.5 μL dNTP mixture;0.5 μL random primer;500 ng預(yù)變性后的total RNA;用RNase-Free ddH2O補足到10 μL。反應(yīng)程序:體系混勻后,37℃水浴反應(yīng)15 min,98℃水浴5 min,使反轉(zhuǎn)錄酶失活。反應(yīng)完成后,用超純水稀釋4倍備用,即獲得cD NA。定量PCR反應(yīng)10 μL體系基本組成:1 μL模板 cDNA;5 μL SYBR Premix Ex Taq(2×);0.4 μL前引物;0.4 μL后引物 (引物序列詳見表1);用超純水補足到10 μL。使用RT-PCR儀(Mastercycler eppendorf realplex,USA)進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性1 min,95℃退火15 s,60℃延伸1 min,共40個循環(huán)。所有操作均在冰上進(jìn)行。

1.6 行為活動分析

對9只大鼠(每組3只)每日行為活動進(jìn)行監(jiān)測分析。每只大鼠單獨飼養(yǎng)在一個籠子內(nèi),籠子的正上方安裝紅外探頭,每5 min采集一次數(shù)據(jù)。將紅外探頭采集接收的數(shù)據(jù)傳輸至電腦上,連續(xù)監(jiān)測3周,實驗結(jié)束后利用CompACTAMS軟件(Activity Monitoring System,Muromachi公司,Japan)分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用2-ΔΔCt法比較閾值循環(huán)數(shù)(Ct),分析基因的相對表達(dá)量[9](以GAPDH作為管家基因進(jìn)行校正),使用歸一法分析基因表達(dá)的變化趨勢。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(x±sx)表示,使用Statview 5.0 software(SAS Institute Inc.,Cary NC,USA)進(jìn)行方差分析,統(tǒng)計中的差異使用單因素方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)進(jìn)行分析。*P＜0.05,有顯著差異;**P＜0.01,差異極顯著;P＞0.05則無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 BECC對大鼠在倒時差條件下肝臟生物鐘基因的影響

肝臟是人體重要器官,受生物鐘系統(tǒng)調(diào)節(jié),日夜顛倒的環(huán)境將導(dǎo)致肝臟受損。我們檢測了肝臟中生物鐘關(guān)鍵基因Bmal1、Cry1在顛倒光周期后第3 d、第5 d的節(jié)律表達(dá),結(jié)果見圖2,統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見表2。為比較不同組間基因表達(dá)的差異,將基因表達(dá)水平的峰值移動時間作為參照,分析BECC對適應(yīng)時差反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。如圖2所示,第3 d時,與Control組相比,BECC組與Normal組中Bmal1與Cry1基因的峰值移動情況有明顯差異,其中,Bmal1基因表達(dá)水平峰值在BECC組中移動了12 h,完成時相重置,在Normal組中只移動了4 h;而Cry1基因的表達(dá)水平峰值在Normal組中移動了8 h,在BECC組中移動了12 h。第5 d時,BECC組與Normal組中Bmal1基因和Cry1基因表達(dá)水平峰值均移動了12 h,均完成時相重置。如表2所示,BECC組中Bmal1和Cry1基因表達(dá)峰值與Control組相比發(fā)生了明顯的移動,且均呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)。

圖2 BECC在倒時差條件下對肝臟生物鐘基因重置的影響Fig.2 The effects of BECC administration on the reset原ting processes of clock genes in the liver of rats after the experimental jet lag

表1 引物序列Table1 Primer sequences used for PCR amplification

表2 BECC對大鼠肝臟中生物鐘基因表達(dá)的影響Table2 Effect of BECC administration on rhythmic expression of the clock genes in rat liver

2.2 BECC對大鼠在倒時差條件下心臟生物鐘基因的影響

心臟中也存在著子鐘,調(diào)節(jié)效應(yīng)器的節(jié)律。因此,我們也檢測了心臟中生物鐘關(guān)鍵基因Bmal1、Cry1在顛倒光周期后第3 d、第5 d的節(jié)律表達(dá),結(jié)果見圖3,統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見表3。如圖3所示,第3 d時,與Control組相比,Bmal1與Cry1基因在Normal組中的表達(dá)水平峰值未移動,但在BECC組中分別移動了8 h與12 h。第5 d時,Bmal1與Cry1基因在BECC組中已經(jīng)完成時相重置,但在Normal組中只移動了8 h與4 h。如表3所示,BECC組中Bmal1基因表達(dá)峰值與Control組相比發(fā)生了明顯的移動,且均呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá);Cry1基因表達(dá)峰值與Control組相比發(fā)生了明顯的移動,但節(jié)律性消失。

圖3 BECC在倒時差條件下對心臟生物鐘基因重置的影響Fig.3 The effects of BECC administration on the reset原ting processes of clock genes in the heart of rats after the experimental jet lag

2.3 BECC對大鼠在倒時差條件下行為活動的影響

為了進(jìn)一步觀察顛倒光周期后大鼠生理行為能力的變化,以及服用BECC后是否能增強大鼠對外界變化環(huán)境的適應(yīng)能力,本實驗監(jiān)測了大鼠顛倒光周期前后的活動行為。如圖4所示,Normal組和BECC組中大鼠的行為動作節(jié)律重置結(jié)果相近。在對照組的光照條件下,大鼠夜間的活動量(約占總運動量的80%)是白晝活動量(約占總運動量的20%)的近4倍。新的光照周期條件下,BECC組和Normal組前3 d的暗期活動量一直明顯少于對照組,且顛倒光周期后的Normal大鼠大約需要5 d才能恢復(fù)到正常光周期大鼠的活動量;與Normal組的大鼠相比,BECC組的大鼠在第4 d時晝夜活動量已恢復(fù),且在第1 d與Normal組相比有顯著的加快。

3 討論

在本實驗中,我們探討了BECC對人為時差條件下哺乳動物生物鐘的影響,包括外周生物鐘基因的表達(dá)水平和行為活動節(jié)律的變化。我們發(fā)現(xiàn),BECC能夠加快外周組織中(肝臟、心臟)生物鐘基因的節(jié)律重置。

在肝臟中,BECC對Bmal1基因峰值相位移動的重置體現(xiàn)出了積極的促進(jìn)作用,如表4所示,由于延長光照時間所產(chǎn)生的12 h時差,Normal組需要5 d才能完成相位的重置,即憑借自身的調(diào)控機制,機體需要5 d才能適應(yīng)新環(huán)境,但是BECC組中Bmal1基因僅需要3 d就能完成重置。Cry1基因峰值相位移動情況差異不大,但是從重置過程分析,顛倒光周期的第3 d,BECC組的峰值就已移動了8 h,而Normal組的峰值相位在第3 d僅移動了4 h,在第5 d才達(dá)到BECC組第3 d的移動水平。通過以上重置過程的比對分析可知,BECC對肝臟中Cry1基因的重置也是有一定促進(jìn)作用的。

表3 BECC對大鼠心臟中生物鐘基因表達(dá)的影響Table3 Effect of BECC administration on rhythmic expression of the clock genes in rat heart

圖4 BECC對大鼠在倒時差條件下行為活動的影響Fig.4 Effects of BECC administration on resetting of the locomotor activity rhythm

在心臟中,BECC組大鼠生物鐘基因的重置速度明顯比Normal組迅速,如表3所示,Bmal1和Cry1基因峰值相位移動在兩組中的變化均存在明顯的差異。在BECC組中,Bmal1基因在第3 d時就明顯移動了8 h,到第5 d就完成了重置,而Normal組中Bmal1的峰值相位在顛倒光周期后的第3 d幾乎沒有移動,直至第5 d才移動8 h;另外,BECC組中,Cry1基因在第3 d就完成了重置,而Normal組在第5 d也僅移動了4 h。由此可見,服用BECC能夠加速紊亂生物鐘的重置,有效地促進(jìn)機體對新環(huán)境的適應(yīng)。

哺乳動物的生物鐘系統(tǒng)由位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)的母鐘和分布于外周各組織、器官的子鐘所構(gòu)成[10]。行為活動是生物鐘母鐘SCN的輸出信號之一,行為活動節(jié)律能夠反映母鐘SCN的重置情況[11]。本實驗檢測了光周期顛倒后各組大鼠的行為活動情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Normal組相比,BECC組大鼠行為活動節(jié)律恢復(fù)速度略有加快,尤其是在光和食物周期顛倒后的第1 d(圖4),由此可見,BECC對大鼠母鐘SCN也有一定的調(diào)控作用,將來進(jìn)一步對母鐘節(jié)律以及其他相關(guān)輸出信號的研究能有助于更好地闡明BECC對生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控作用。

BECC中的活性成分與生理功能存在著密切的聯(lián)系,經(jīng)成分分析,L-肌肽(L-carnosine)是BECC的主要作用成分之一,由β-丙氨酸和L-組氨酸組成,是廣泛存在于多種脊椎動物骨骼肌和大腦中的內(nèi)源性二肽[12]。發(fā)現(xiàn)至今,L-肌肽被證實有多種生理功能。L-肌肽能夠捕捉自由基、抗衰老、螯合金屬離子、緩沖生理pH,并能抑制由轉(zhuǎn)運金屬、血紅蛋白、單線態(tài)氧、脂氧合酶、自由基等催化的脂類氧化[13],保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷、抑制細(xì)胞老化、恢復(fù)衰老細(xì)胞活力[14],同時還具有神經(jīng)保護(hù)和血管舒張等作用[15]。2007年,Tanida等[16]證實L-肌肽在生物鐘母鐘信息傳遞過程有重要作用。因此,BECC能夠加快大鼠適應(yīng)由光周期顛倒引起的時差反應(yīng)可能在一定程度上是通過其中的L-肌肽發(fā)揮作用的。

表4 生物鐘基因表達(dá)峰值的相位移動Table4 The phase shift of clock gene expression compared with the control group

在生物鐘分子機制的反饋回路中,CLOCK/NPAS與BMAL1形成的CLOCK/BMAL1或NPAS/BMAL1二聚體與E-box結(jié)合,調(diào)控Per和Cry基因表達(dá),同時抑制這些異源二聚體啟動的Reverbα、Dbp等基因的轉(zhuǎn)錄,影響下游一系列鐘控基因的表達(dá)[17～19]。Mongrain 等[20]研究指出,在睡眠紊亂的小鼠中,BMAL1/CLOCK和NPAS結(jié)合到Per1和Dbp啟動子上的程度發(fā)生了顯著的變化,而L-肌肽可能通過改變兩者的結(jié)合程度來加快生物鐘子鐘的重置。研究L-肌肽在分子水平上對生物鐘基因的調(diào)控作用,將有助于進(jìn)一步闡明BECC對生物鐘調(diào)控的分子機制。

需要指出的是,本實驗僅研究了BECC對部分生物鐘子鐘基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用,進(jìn)一步對母鐘和其他子鐘以及其他生物鐘基因表達(dá)的研究,可以更加全面地解析BECC在生物鐘調(diào)控方面的作用。另外,通過對大鼠相關(guān)生理代謝水平及其調(diào)控機制的研究,將有助于闡明BECC作為緩解時差反應(yīng)的功能性食品的潛在可能性。

綜上所述,本研究通過短期顛倒光周期,破壞內(nèi)源性晝夜節(jié)律,構(gòu)建大鼠時差模型,同時外源補充BECC,采用紅外探頭監(jiān)測大鼠每日行為活動,熒光定量PCR分析外周組織(肝臟和心臟)中生物鐘基因轉(zhuǎn)錄水平,從生理內(nèi)外表象、基因轉(zhuǎn)錄水平層面研究了BECC對大鼠在短期倒時差情況下適應(yīng)環(huán)境與維持代謝穩(wěn)態(tài)的作用效果,實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),外源服用BECC后,能有效地加快生物鐘基因的重置。因此,BECC作為一種功能性食品,在一定程度上可以預(yù)防和緩解由快節(jié)奏生活引起的生物鐘紊亂所導(dǎo)致的生理不適,但BECC作為功能性食品在其他方面的影響仍需繼續(xù)研究。

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