李 平,胡建燃,史寶忠

(長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系,中國山西長治046011)

補(bǔ)體系統(tǒng)是人體重要的防御系統(tǒng)之一,在抵御病原微生物、清除機(jī)體代謝廢物以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而,在某些情況下,補(bǔ)體系統(tǒng)可能被異常激活,誘發(fā)多種疾病,包括風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植中的超急性排斥反應(yīng)等[1]。同時,急性呼吸窘迫綜合征、急性心肌梗死等急性疾病也可能是補(bǔ)體系統(tǒng)異常激活所導(dǎo)致[2]。另外,已有研究發(fā)現(xiàn)重癥非典型性肺炎(severe acute respiratory syndrome,SARS)也與補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活有關(guān)[3,4]。由此可見,抑制補(bǔ)體系統(tǒng)活性是治療上述疾病的重要途徑之一。

目前,臨床上使用的免疫抑制劑主要包括環(huán)磷酰胺、糖皮質(zhì)激素、甲胺蝶呤等。這些藥物在一定程度上能夠緩解補(bǔ)體過度激活所誘發(fā)的疾病,但是長期使用則可能產(chǎn)生多種副作用和并發(fā)癥[5,6]。因此,尋找高效低毒的新型補(bǔ)體抑制劑成為臨床治療該類疾病的當(dāng)務(wù)之急。有研究表明,藥用植物中廣泛存在著具有抗補(bǔ)體活性的成分,包括多糖、蛋白質(zhì)、生物堿、黃酮、甾類等[7],這些天然活性成分大多對機(jī)體低毒,且可被機(jī)體直接消化吸收。因此,從藥用植物中尋找新型高效的抗補(bǔ)體物質(zhì)具有重要意義。

黨參是名貴的傳統(tǒng)中藥材,為桔?？浦参稂h參、素花黨參或川黨參的干燥根,分布廣泛。潞黨參主要分布于山西省東南部長治地區(qū),品質(zhì)甚優(yōu),自古即被視為黨參中的珍品,發(fā)揮益氣養(yǎng)血、生津健脾、益肺消渴之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,黨參具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等藥理作用,而多糖是其主要活性成分[8]。目前,關(guān)于黨參多糖在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面的作用研究逐漸受到重視。例如:王愛青[9]的研究表明黨參多糖能夠改變大鼠血清中IL-2、IL-6等免疫因子的水平,改善其腎陰虛癥狀;李開菊等[10]認(rèn)為素花黨參多糖能夠顯著提高烏雞體內(nèi)的法氏囊指數(shù)水平,增強(qiáng)其機(jī)體免疫功能;王希春等[11]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加1%～2%的黨參多糖能夠顯著提高仔豬血清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的水平以及小腸黏膜分泌SIgA的水平,改善仔豬的生長性能;有研究發(fā)現(xiàn),硒化黨參多糖能夠有效提高雞和小鼠外周血中的免疫因子含量,增強(qiáng)其免疫功能[12,13];余蘭等[14]研究發(fā)現(xiàn)道真洛龍黨參多糖可通過提高胸腺和脾臟指數(shù),減輕環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能抑制。然而,關(guān)于潞黨參多糖在免疫調(diào)節(jié)方面的研究,目前尚未見報道。

在前期工作中,本研究室優(yōu)化了潞黨參多糖(LuCodonopsis pilosulapolysaccharides,LCPP)的提取方法,并對LCPP的生理活性進(jìn)行了初步探索,發(fā)現(xiàn)LCPP具有良好的體外抗氧化活性[15]以及一定的抑制人宮頸癌細(xì)胞SiHa增殖和遷移的作用[16]。但是,關(guān)于LCPP影響補(bǔ)體系統(tǒng)活性的研究鮮見報道。本研究采用溶血法、實時定量PCR等技術(shù)探討LCPP的抗補(bǔ)體活性,旨在為尋求新型天然補(bǔ)體抑制劑開辟路徑,同時為潞黨參的深層次開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M2(美谷分子儀器(上海)有限公司);5805臺式高速離心機(jī)(北京博瑞祥騰科技有限公司);KQ-250醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BSA 124S-CW電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);細(xì)胞計數(shù)儀Cellometer Auto1000(美國Nexcelom公司);倒置顯微鏡CKX41-C31BF(日本Olympus公司);高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司);StepOne-Plus型實時定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 材料與試劑

潞黨參購自長治市萬民藥房;綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell,SRBC)、綿羊紅細(xì)胞溶血素、巴比妥酸等購自南京森貝伽生物科技有限公司;豚鼠血清購自廣州鴻泉生物科技有限公司;肝素鈉、EGTA等購自北京依托華茂生物科技有限公司;人肝癌細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;DMEM培養(yǎng)基購自北京索來寶生物科技有限公司;胎牛血清購買于杭州四季青生物工程材料有限公司;TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)購自美國 Sigma公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTMGC試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 LCPP的提取

參照文獻(xiàn)報道方法[15],利用微波輔助的乙醇沉淀法提取LCPP,并通過Sevag法和透析法去除蛋白質(zhì)、小分子等雜質(zhì),精制多糖。

1.3.2 經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性(CH50)測定

先用1×巴比妥酸溶液(1×BBS溶液)將豚鼠血清(補(bǔ)體)稀釋10倍,然后繼續(xù)對倍稀釋成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640 和 1∶1 280共7個濃度梯度的溶液。實驗分為補(bǔ)體組(complement group)和全溶血組(hemolysis group),按照表1,補(bǔ)體組依次準(zhǔn)確加入1×BBS溶液、補(bǔ)體(complement)、溶血素(hemolysin)和2%綿羊紅細(xì)胞(SRBC),輕柔混勻;全溶血組則依次加入蒸餾水和2%SRBC,輕柔混勻。然后,將補(bǔ)體組和全溶血組均置于37℃孵育30 min,4℃下5 000 r/min離心10 min后每個反應(yīng)體系吸取200 μL上清液置于96孔板中,利用酶標(biāo)儀測定405 nm處的光吸收值(OD405)。以全溶血組的OD405值為標(biāo)準(zhǔn),計算綿羊紅細(xì)胞溶血率,溶血率(%)=補(bǔ)體組OD405值/全溶血組OD405值×100%,選擇溶血率接近100%的最低補(bǔ)體濃度為臨界濃度。補(bǔ)體組中每個濃度梯度以及全溶血組均做3個重復(fù)。

用1×BBS溶液溶解精制的LCPP,制成濃度為25 mg/mL的溶液。繼續(xù)用1×BBS溶液,按照2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和 128倍的比例對上述LCPP溶液進(jìn)行梯度稀釋。然后,設(shè)置實驗組(test group)共7個濃度梯度,對應(yīng)7個對照組(control group),以及1個臨界點濃度的補(bǔ)體組,每組設(shè)置3個重復(fù)。按照表2加入各試劑后(操作同表1),測定OD405值,計算溶血抑制率,溶血率抑制率 (%)=1-(補(bǔ)體組OD405值-對照組OD405值)/補(bǔ)體組OD405值×100%,然后利用SPSS 10.0軟件計算CH50值。

1.3.3 旁路途徑抗補(bǔ)體活性(AP50)測定

參照文獻(xiàn)方法[17],取健康成年男性靜脈血10 mL,以及家兔(約2.5 kg)動脈血2 mL,制備人血清和0.5%兔紅細(xì)胞(rabbit red blood cell,RRBC),置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?并配制旁路途徑(alternative pathway,AP)緩沖液,對人血清(補(bǔ)體)進(jìn)行5倍稀釋,然后依次對倍稀釋為10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍的溶液。按照表3加入各試劑,輕柔混勻,置于37℃孵育30 min,然后在4℃下5 000 r/min離心10 min,每個反應(yīng)體系吸取200 μL上清液置于96孔板中,利用酶標(biāo)儀測定OD405值,以全溶血組的OD405值為標(biāo)準(zhǔn),計算兔紅細(xì)胞溶血率,選擇溶血率接近100%的最低補(bǔ)體濃度為臨界濃度。

用AP溶液配制濃度為25 mg/mL的LCPP溶液,然后按照2倍、4倍、8倍、16倍和32倍的比例,用AP溶液對上述LCPP溶液進(jìn)行梯度稀釋,按照表4加入各試劑后(操作同上),測定OD405值,計算溶血抑制率,然后計算AP50值。

1.3.4 HepG2細(xì)胞的處理及real-time PCR實驗

用胰酶-EDTA溶液消化指數(shù)增長期的人HepG2細(xì)胞,成單細(xì)胞懸液,接種到Φ35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待匯合率達(dá)到60%時,分別在加入和不加入LCPP情況下,用終濃度為50 ng/mL的TNF-α處理細(xì)胞,在不同時間點收集細(xì)胞,并按照TRIzol試劑說明書提取總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,保存于-70℃冰箱備用。

利用表5中所列的引物,按照SYBR?Premix Ex TaqTMGC試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為95℃5 min;95℃5 s;60℃30s;40個循環(huán)。利用2-△△Ct方法計算基因mRNA的相對水平。

表1 經(jīng)典途徑補(bǔ)體臨界濃度的確定(mL)Table1 Identification of the critical concentration of complement in the classical pathway(mL)

表2 補(bǔ)體經(jīng)典途徑溶血實驗(mL)Table2 Hemolysis assay of the classical pathway(mL)

表3 旁路途徑中補(bǔ)體臨界濃度的確定(mL)Table3 Identification of the critical concentration of complement in the alternative pathway(mL)

表4 補(bǔ)體旁路途徑溶血實驗(mL)Table4 Hemolysis assay of the alternative pathway(mL)

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

每個反應(yīng)體系均設(shè)有3個重復(fù),統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。利用SPSS 10.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,并進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCPP經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性

2.1.1 經(jīng)典途徑補(bǔ)體臨界點濃度的確定

紅細(xì)胞在發(fā)生輕微溶血和接近完全溶血時,補(bǔ)體量的變化不能使溶血程度有顯著改變,即溶血對補(bǔ)體量的變化不敏感。為檢測LCPP是否對補(bǔ)體所引起的溶血過程產(chǎn)生影響,需確定本實驗體系中溶血發(fā)生突躍的補(bǔ)體稀釋區(qū)間,選擇適宜的補(bǔ)體濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。將不同稀釋倍數(shù)的豚鼠血清(補(bǔ)體)分別與2%的綿羊紅細(xì)胞以及1 000倍稀釋的綿羊紅細(xì)胞溶血素混合,測定OD405值,計算溶血率。以溶血率為縱坐標(biāo),稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)繪制折線圖。如圖1所示,當(dāng)補(bǔ)體稀釋80倍時,溶血率為88.42%,稀釋倍數(shù)超過80后,溶血率顯著下降,因此,在后續(xù)實驗中選擇80倍稀釋的豚鼠血清作為補(bǔ)體使用。

2.1.2 LCPP對補(bǔ)體經(jīng)典途徑的影響

用1×BBS溶液將LCPP和肝素鈉分別配制成25 mg/mL和0.5 mg/mL的溶液,然后繼續(xù)用1×BBS溶液將二者按照2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍進(jìn)行梯度稀釋。通過綿羊紅細(xì)胞溶血實驗,以肝素鈉為陽性對照,檢測LCPP對補(bǔ)體經(jīng)典途徑的影響。結(jié)果如圖2所示,LCPP對補(bǔ)體經(jīng)典途徑具有抑制作用,經(jīng)計算CH50為2.061±0.127 mg/mL,肝素鈉CH50值為0.056±0.004 mg/mL,P＜0.01。

圖2 LCPP對補(bǔ)體經(jīng)典途徑的抑制效應(yīng)Fig.2 Anti-complementary activities of LCPP on the classical pathway

2.2 LCPP對補(bǔ)體旁路途徑的影響

2.2.1 旁路途徑補(bǔ)體臨界點濃度的確定

按照表3中的體積,將不同濃度的人血清、0.5%的兔血清以及AP溶液混合,測定兔紅細(xì)胞溶血率。結(jié)果如圖3所示,人血清稀釋10倍時,溶血率為93.20%,當(dāng)稀釋倍數(shù)繼續(xù)增大,溶血率顯著下降。因此,在后續(xù)實驗中,以10倍稀釋的人血清作為補(bǔ)體使用。

圖3 不同稀釋倍數(shù)的人血清在補(bǔ)體旁路途徑中的效價Fig.3 The hemolysis capacities of the different dilutions of human sera on the alternative pathway

表5 Real-time PCR引物信息Table5 Amplification primers for real-time PCR

2.2.2 LCPP對補(bǔ)體旁路途徑的抑制效應(yīng)

用AP溶液分別配制25 mg/mL的LCPP溶液和0.5 mg/mL的肝素鈉溶液,并繼續(xù)按照2倍、4倍、8倍、16倍和32倍對二者進(jìn)行梯度稀釋。以肝素鈉溶液為陽性對照,通過兔紅細(xì)胞溶血實驗,檢測LCPP對補(bǔ)體旁路途徑活性的影響。結(jié)果如圖4所示,LCPP對補(bǔ)體旁路途徑具有抑制作用,經(jīng)計算 AP50值為 6.725±0.895 mg/mL,肝素鈉AP50值為 0.075±0.005 mg/mL,P＜0.01。

圖4 LCPP對補(bǔ)體旁路途徑活性的影響Fig.4 Anti-complementary activities of LCPP on the alternative pathway

2.3LCPP對TNF-α誘導(dǎo)的C3表達(dá)水平的影響

用TNF-α(終濃度50 ng/mL)刺激人 HepG2細(xì)胞,然后通過實時定量PCR檢測補(bǔ)體成分C3的mRNA水平,結(jié)果如圖5所示,隨著TNF-α處理時間的延長,C3 mRNA表達(dá)量逐漸增加。若用LCPP和TNF-α同時處理HepG2細(xì)胞24 h,C3的mRNA水平則與LCPP的濃度呈負(fù)相關(guān)(圖6),這種抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。上述結(jié)果表明,LCPP能夠拮抗TNF-α誘導(dǎo)的補(bǔ)體因子C3水平的升高。

圖5 TNF-α對人HepG2細(xì)胞補(bǔ)體成分C3表達(dá)的影響Fig.5 Effect of TNF-α on C3 expression in HepG2 cells

圖6 LCPP抑制TNF-α誘導(dǎo)的人HepG2細(xì)胞中C3的表達(dá)Fig.6 LCPP suppressed C3 expression in TNF-α-me原diated HepG2 cells

3 討論

補(bǔ)體系統(tǒng)是動物免疫系統(tǒng)的重要組成部分,其中,經(jīng)典途徑的主要參與因子是C1～C9,旁路途徑的主要參與因子為C3、C5～C9以及P因子和B因子等。肝素及其衍生物是一類臨床上常見的抗凝血劑,同時也具有強(qiáng)大的抗補(bǔ)體作用[18],其主要通過與多種補(bǔ)體因子相結(jié)合,阻礙免疫復(fù)合物的形成,從而抑制補(bǔ)體系統(tǒng)活性[19]。近年來,有大量研究以藥用植物為研究對象,分析其提取物的免疫調(diào)節(jié)作用,其中針對補(bǔ)體系統(tǒng)的效應(yīng)是研究的熱點之一。例如,阮姝楠等[20]從廣藿香中分離得到的槲皮素-7,3′,4′-三甲醚對補(bǔ)體經(jīng)典途徑和旁路途徑具有較強(qiáng)的抑制效果,并確定了其作用靶點為 C1q、C2、C5和C9;吳彥等[21]的研究表明,與陽性對照肝素相比,半枝蓮中的多糖成分B3-PS2具有與之相當(dāng)?shù)捏w外抗補(bǔ)體活性;張娟娟等[22]采用優(yōu)化的提取方法獲得的魚腥草多糖具有較強(qiáng)的抗補(bǔ)體活性,CH50值為0.079 mg/mL;焦楊等[23]比較了千解草、白花燈籠、尖尾楓、赪桐、臭茉莉等5種馬鞭草科藥用植物提取物的抗補(bǔ)體活性,結(jié)果顯示它們在經(jīng)典途徑和旁路途徑均表現(xiàn)出不同程度的抑制效應(yīng);楊濤等[24]在紅芪中分離得到一種新多糖HPS1-D,發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗補(bǔ)體活性,CH50值為0.21 mg/mL。本研究以肝素鈉為陽性對照,采用細(xì)胞溶血實驗,探討LCPP潛在的抗補(bǔ)體活性,結(jié)果顯示LCPP的CH50值和AP50值分別為2.061±0.127 mg/mL、6.725±0.895 mg/mL,雖然大于肝素鈉的 CH50值(0.056±0.004 mg/mL)和 AP50值(0.075±0.005 mg/mL),但是仍然能夠在一定程度上抑制補(bǔ)體所導(dǎo)致的紅細(xì)胞溶血,因此LCPP具有一定的抗補(bǔ)體活性。

動物補(bǔ)體系統(tǒng)可能因為某些外部或內(nèi)部因素的影響而異常激活,從而導(dǎo)致某些疾病或器官損傷,如果通過藥物及時抑制補(bǔ)體系統(tǒng)活性,就有可能改善相關(guān)癥狀。例如,姚楠等[25]的研究表明脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激能夠明顯提高HEK293細(xì)胞中IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達(dá),而TNF-α能誘導(dǎo)人腎近曲小管上皮細(xì)胞中補(bǔ)體因子C3 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高,導(dǎo)致腎損傷[26]。Shavva等[27]用TNF-α蛋白刺激人HepG2細(xì)胞,顯著增強(qiáng)了其補(bǔ)體因子C3的表達(dá)。褚純雋等[28]報道LPS能夠刺激小鼠C3、TNF-α、IL-6等因子水平的升高,導(dǎo)致急性肺損傷,而藥用植物野馬追的提取物則能夠有效降低上述因子的水平,從而起到保護(hù)作用。此外,有研究表明,當(dāng)某些魚類被細(xì)菌感染后,體內(nèi)補(bǔ)體因子C3和B的表達(dá)均顯著升高[29]。王志平等[30]發(fā)現(xiàn)LPS處理斑馬魚后,最終顯著提高其C3和補(bǔ)體因子Bf的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠提高人HepG2細(xì)胞中補(bǔ)體因子C3的mRNA水平,而LCPP則能有效拮抗TNF-α的刺激作用,降低C3的表達(dá),呈現(xiàn)量效關(guān)系。因此,在由于補(bǔ)體系統(tǒng)異常激活導(dǎo)致的疾病中,潞黨參的多糖成分可能通過降低補(bǔ)體因子C3的表達(dá),抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的活性,達(dá)到緩解癥狀或治療的作用。

那巖鷹翼展過丈，黑羽灰斑，帶著巖石般的厚重紋路，看上去身軀極為結(jié)實。它抓著一條黑蟒，那黑蟒有成人手臂粗細(xì)，七八尺長，在鋼鉤般的鷹爪下一動不動地耷拉著，頗為瘆人。

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