安韶雅,虎 娟,張 虹,孫 放,馬 霞,王 晨,陳 任

(1.寧夏大學(xué)寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)寧夏銀川750021;2.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)寧夏銀川750021;3.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)寧夏銀川750021)

自1984年首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草[1]以來(lái),以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的植物基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用為植物的遺傳改良開(kāi)拓了廣闊的前景。轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)將人工分離和修飾過(guò)的基因(包括來(lái)源于不同物種甚至人工合成的基因)導(dǎo)入到生物體基因組后,借助導(dǎo)入基因的表達(dá),引起生物體性狀發(fā)生可遺傳的改變,在一定程度上有效提高目標(biāo)性狀改良的效率和準(zhǔn)確性,從而實(shí)現(xiàn)由表型選擇到基因型選擇的過(guò)渡,大大加快了新品種培育進(jìn)程。

在基因工程的研究與應(yīng)用過(guò)程中,基因克隆、載體構(gòu)建是必需的常規(guī)步驟。采用合適的表達(dá)載體和構(gòu)建方法會(huì)使實(shí)驗(yàn)效果事半功倍。但是,目前常用于植物基因表達(dá)載體構(gòu)建的質(zhì)粒載體,如pBIN19[2]、pBI121[3]、pIG121-Hm[4]、pMSIsGFP[5]和pCAMBIA系列[6]等,由于其T-DNA區(qū)段中限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)有限,外來(lái)基因片段難于插入和連接,有時(shí)還需要構(gòu)建多個(gè)中間載體,操作比較麻煩,而且這些經(jīng)典的質(zhì)粒載體,有些只限于在研究者同行間互相轉(zhuǎn)讓,沒(méi)有商業(yè)化;有些由于專(zhuān)利限制,只能在研究和實(shí)驗(yàn)等非經(jīng)營(yíng)目的的小范圍內(nèi)使用,基因轉(zhuǎn)化后的新品種(系)無(wú)法在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。因此建立一個(gè)簡(jiǎn)單高效的、專(zhuān)門(mén)用于植物基因表達(dá)載體構(gòu)建的質(zhì)粒載體具有現(xiàn)實(shí)意義。

為解決上述問(wèn)題,本研究利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的經(jīng)大腸桿菌(Escherichia coli)質(zhì)粒pUC18[7]改造的pKAFCR1和經(jīng)雙核農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefa ciens)Ti(tumor inducing)質(zhì)粒pBI121改造的pKAFCR100兩種質(zhì)粒[8],在pKAFCR1的CaMV 35S啟動(dòng)子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS終止子(nopaline synthase terminator)之間,引入多克隆酶切位點(diǎn)MCS(multiple cloning site),然后將包含35S-MCS-NOS的片段切下來(lái)連接到pKAFCR100,使其成為一個(gè)用于構(gòu)建植物基因表達(dá)的質(zhì)粒載體pNULPGE200。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

pKAFCR1和pKAFCR100質(zhì)粒(寧夏大學(xué)植物基因工程研究室,專(zhuān)利號(hào)CN201610767834.4)[8];LB培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司);植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、抗生素和MS培養(yǎng)基等(Sigma-Aldrich公司,美國(guó));各種限制性內(nèi)切酶(Takara公司,日本);凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit、PCR產(chǎn)物純化試劑盒QIAquick PCR Purification Kit、質(zhì)粒提取試劑盒QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司,德國(guó));質(zhì)粒連接試劑盒Ligation High Kit、DNA平滑化試劑盒Blunting High Kit(Toyobo公司,日本);植物基因組DNA提取試劑盒Plant Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司);PCR試劑盒Ex-Taq PCR(Takara公司,日本);大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞(上海邁其生物科技有限公司)。

1.2 pKAFCR1質(zhì)粒多克隆酶切位點(diǎn)MCS的改造

利用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI對(duì)pKAFCR1進(jìn)行雙酶切處理;經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后,切取目的條帶,通過(guò)凝膠回收試劑盒回收獲得已切除XbaI-SacI小部分的pKAFCR1。人工合成兩條單鏈DNA(CR1 MCS Adapter-S、CR1 MCS Adapter-A,表1),采用溫度梯度退火法使兩條單鏈DNA構(gòu)成一條雙鏈DNA接頭,該接頭含有限制性內(nèi)切酶XbaI、HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI位點(diǎn);利用質(zhì)粒連接試劑盒將該接頭與切除XbaI-SacI小部分的pKAFCR1進(jìn)行連接;利用熱激法將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中;將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌平涂于含有25 mg/L青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,37℃黑暗培養(yǎng)12 h后,挑取單獨(dú)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定(采用CR1 35SHind-S、CR1 MCS Adapter-A,CR1 35SHind-S、CR1 NOSEcoR-A引物,表1),篩選含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落;利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA,將該重組質(zhì)粒命名為pKAFCR1+MCS。利用M13-F、M13-R引物(表1)對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 pNULPGE200質(zhì)粒載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和StuI,對(duì)pKA-FCR100進(jìn)行雙酶切處理。通過(guò)凝膠電泳分離、回收,獲得雙酶切后的pKAFCR100;同樣利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和PvuⅡ,對(duì)pKAFCR1+MCS進(jìn)行雙酶切處理,通過(guò)凝膠電泳分離、回收后獲得包含35S-MCS-NOS片段。利用質(zhì)粒連接試劑盒將35S-MCS-NOS片段與酶切后的pKAFCR100進(jìn)行連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化,用含有50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基篩選,菌落PCR鑒定(采用CR100 Hind35SS、CR100 omega-A,CR100 Hind35S-S、CR1 Adapter-A,GFP-F、GFP-R,NPT-F、NPT-R引物,表1)。將所獲重組質(zhì)粒命名為pNULPGE200。利用CR100 Hind35S-S、CR100 omega-A 引物(表1)對(duì)pNULPGE200進(jìn)行雙向測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 pNULPGE200在植物基因表達(dá)載體構(gòu)建中的應(yīng)用

參照NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的假單胞菌(Pseudomonas putida)攜帶質(zhì)粒的二甲苯單加氧酶(xylene monooxygenase,PpXylM+XylA)編碼基因(E02361)的序列,經(jīng)密碼子優(yōu)化后人工合成DNA片段(2 312 bp),同時(shí)在5’和3’端分別引入PacI和KpnI酶切位點(diǎn)序列(共2 326 bp)。利用限制性內(nèi)切酶PacI和KpnI,對(duì)pNULPGE200和人工合成DNA片段進(jìn)行雙酶切處理,凝膠電泳分離回收后進(jìn)行連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、卡那霉素篩選和菌落PCR鑒定(采用 PpXylM-S、PpXylA-A,GFP-F、GFP-R,NPT-F、NPT-R引物,表1),將獲得的基因表達(dá)載體命名為pNULPGE04101。

為了對(duì)比實(shí)驗(yàn),以同樣方法,首先將經(jīng)PacI和KpnI雙酶切處理后的人工合成PpXylM+XylA基因片段(共2 326 bp)與同樣酶切的pKAFCR1+MCS(3 793 bp)進(jìn)行連接,構(gòu)建一個(gè)過(guò)渡載體,使PpXylM+XylA基因片段的上下游分別加上35S和NOS。然后利用限制性內(nèi)切酶PvuⅡ處理,切下含有35S-PpXylM+XylA-NOS的片段,與經(jīng)限制性內(nèi)切酶SbfI單酶切、DNA平滑化試劑盒處理的pBI121[3]連接,獲得的對(duì)照載體命名為pBI121-PpXylM+XylA。利用 PpXylM-SS、PpXylM-SA 引物(表1)對(duì) pNULPGE04101、pBI121-PpXylM+XylA進(jìn)行雙向測(cè)序驗(yàn)證。

利用質(zhì)粒提取試劑盒分別從大腸桿菌DH5α提取pNULPGE04101和pBI121-PpXylM+XylA兩種載體DNA,分別取適量(＜1 μg)并利用熱激法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌株的感受態(tài)細(xì)胞中,同樣進(jìn)行菌落PCR鑒定后,保存陽(yáng)性菌液。陽(yáng)性菌液可以用于植物基因轉(zhuǎn)化。

以上所有具體操作步驟均按照試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 pNULPGE200構(gòu)建的基因表達(dá)載體在植物基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

以實(shí)驗(yàn)室培育的白色矮牽牛(Petunia hybrid)無(wú)菌苗的葉片為材料,用含有上述構(gòu)建的質(zhì)粒pNULPGE04101以及對(duì)照質(zhì)粒pBI121-PpXylM+XylA的農(nóng)桿菌EHA105進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。選用長(zhǎng)勢(shì)良好的葉片,切成約5 mm大小的方塊,在OD550=0.25濃度的農(nóng)桿菌中侵染,于22℃、黑暗條件下共培養(yǎng)3 d后,移至 25 ℃、有效光量子密度 30 μmol/(m2·s)、光照16 h/d條件下進(jìn)行愈傷組織、不定芽、不定根誘導(dǎo)和篩選(表2),培育轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌感染、基因轉(zhuǎn)化、sGFP熒光觀察和GUS(β-glucuronidase)分析等操作均按照實(shí)驗(yàn)室以往的方法[9,10]進(jìn)行。采取各轉(zhuǎn)基因植株的葉片80～100 mg,利用植物基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA,進(jìn)行PCR鑒定,采用 PpXylM-S、PpXylA-A 為引物(表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pKAFCR1質(zhì)粒多克隆酶切位點(diǎn)MCS的改造及鑒定

pKAFCR1(3 796 bp)經(jīng)XbaI和SacI雙酶切處理后,凝膠電泳分離回收獲得已切除XbaISacI(1 265～1 294)部分的 pKAFCR1(3 766 bp,圖1A)。將其與人工合成DNA接頭(48 bp)連接形成的重組質(zhì)粒pKAFCR1+MCS(3 814 bp)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后,經(jīng)菌落PCR鑒定,確認(rèn)電泳條帶正確(954 bp,1 243 bp,圖1B),說(shuō)明人工合成DNA接頭已連接到pKAFCR1的XbaI-SacI酶切位點(diǎn)。

利用M13-F和M13-R引物對(duì)重組質(zhì)粒pKAFCR1+MCS進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定,結(jié)果表明上述構(gòu)建連接正確。這樣構(gòu)建形成的pKAFCR1+MCS在35S啟動(dòng)子與NOS終止子之間加入了XbaI、HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI多克隆酶切位點(diǎn)MCS(圖2)。

2.2 pNULPGE200質(zhì)粒載體的構(gòu)建及鑒定

pKAFCR100(13 221 bp)經(jīng)HindⅢ和StuI雙酶切處理后,凝膠電泳分離回收獲得已切除HindⅢ-StuI小部分的pKAFCR100(13 206 bp,圖3A);pKAFCR1+MCS(3 814 bp)經(jīng)HindⅢ和PvuⅡ雙酶切處理,凝膠電泳分離回收獲得包含35SMCS-NOS的片段(1 358 bp,圖3B);將回收獲得的pKAFCR100與35S-MCS-NOS片段連接后形成的重組質(zhì)粒pNULPGE200(14 564 bp)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,經(jīng)菌落PCR鑒定,確認(rèn)電泳條帶正確(1 857 bp、963 bp、611 bp、776 bp,圖3C),說(shuō)明 pKAFCR1+MCS的35S-MCS-NOS片段已插入到pKAFCR100的HindⅢ-StuI酶切位點(diǎn)。

表1 各種PCR引物和DNA接頭Table1 Primers and adapters

圖1 pKAFCR1質(zhì)粒酶切以及pKAFCR1+MCS質(zhì)粒構(gòu)建后的菌落PCR鑒定Fig.1 Restriction digestion of pKAFCR1 and colony PCR for identification of the constructed pKAFCR1+MCS plasmid

利用 CR100 Hind35S-S、CR100 omega-A 引物對(duì)pNULPGE200進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定,結(jié)果表明上述構(gòu)建連接正確。這樣構(gòu)建形成的pNULPGE200具有35S-MCS-NOS,經(jīng)PCR等方法克隆得到的目的基因可以多種方式很方便地連接到35S啟動(dòng)子與NOS終止子之間,使目的基因能夠在植物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá);該質(zhì)粒載體同時(shí)還具有獨(dú)立表達(dá)的卡那霉素NPTⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)耐性基因和sGFP(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)綠色熒光蛋白報(bào)告基因,可用于基因轉(zhuǎn)化時(shí)的篩選(圖4)。

2.3 pNULPGE200在植物基因表達(dá)載體構(gòu)建中的應(yīng)用

為了驗(yàn)證文中所構(gòu)建的pNULPGE200的使用效果,以假單胞菌攜帶質(zhì)粒的二甲苯單加氧酶編碼基因(PpXylM+XylA)片段為材料進(jìn)行了基因表達(dá)載體的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。pNULPGE200(14 564 bp)經(jīng)PacI和KpnI雙酶切(14 544 bp)后,與同樣酶切處理的PpXylM+XylA(2 320 bp)片段進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)菌落PCR鑒定,確認(rèn)電泳條帶正確(2 333 bp、611 bp和776 bp,圖5),說(shuō)明該基因片段已正確連接到pNULPGE200的35S啟動(dòng)子與NOS終止子之間的PacI和KpnI酶切位點(diǎn)上。這樣獲得的基因表達(dá)載體pNULPGE04101(16 865 bp,圖6),其目的基因的上游和下游分別連接了啟動(dòng)子和終止子,轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌后可用于植物基因轉(zhuǎn)化、目的基因功能研究等。

與pNULPGE200相比,目的基因構(gòu)建到對(duì)照載體pBI121比較麻煩,因?yàn)閜BI121在目的基因插入的多克隆酶切位點(diǎn)的上下游缺少目的基因獨(dú)立表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子。首先,PpXylM+XylA基因片段經(jīng)PacI和KpnI雙酶切后(2 320 bp),與經(jīng)同樣酶切的過(guò)渡載體pKAFCR1+MCS(3 793 bp)進(jìn)行連接,在上下游分別加上35S啟動(dòng)子和NOS終止子。然后,利用PvuⅡ切下含有35S-PpXylM+XylA-NOS的片段(3 769 bp),將該片段與經(jīng)限制性內(nèi)切酶SbfI單酶切、DNA平滑化試劑盒處理的pBI121(14 587 bp)連接,構(gòu)建成對(duì)照載體pBI121-PpXylM+XylA(圖7)。經(jīng)雙向測(cè)序驗(yàn)證,確定pNULPGE04101、pBI121-PpXylM+XylA構(gòu)建正確。

圖3 pKAFCR100和pKAFCR1+MCS質(zhì)粒酶切以及pNULPGE200質(zhì)粒構(gòu)建后的菌落PCR鑒定Fig.3 Restriction digestion of pKAFCR100 and pKAFCR1+MCS and colony PCR for identification of the constructed pNULPGE200 plasmid

圖4 pNULPGE200質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段及多克隆酶切位點(diǎn)Fig.4 The T-DNA region and the multiple cloning sites of pNULPGE200 plasmid

圖5 pNULPGE04101基因表達(dá)載體構(gòu)建后的菌落PCR鑒定Fig.5 Colony PCR for identification of the constructed gene expression vector pNULPGE04101

2.4 pNULPGE200構(gòu)建的基因表達(dá)載體在植物基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

用含有基因表達(dá)載體pNULPGE04101以及對(duì)照載體pBI121-PpXylM+XylA的農(nóng)桿菌EHA105對(duì)矮牽牛無(wú)菌苗的葉片外植體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。經(jīng)侵染、共培養(yǎng)、愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)與篩選后,15 d左右部分葉片切口部位開(kāi)始膨脹變大,隨后生成愈傷組織。30 d后,愈傷組織表面陸續(xù)形成芽點(diǎn),這些芽點(diǎn)逐漸發(fā)育成為不定芽。不定芽伸長(zhǎng)后,繼而進(jìn)行不定根誘導(dǎo)以生成完整植株。再生植株經(jīng)基因組PCR鑒定,證實(shí)構(gòu)建到基因表達(dá)載體pNULPGE04101以及對(duì)照載體pBI121-PpXylM+XylA的T-DNA區(qū)段的PpXylM+XylA基因已經(jīng)導(dǎo)入到矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株(圖8)。整個(gè)分化過(guò)程中,在抗生素(卡那霉素)篩選的同時(shí),利用sGFP熒光和GUS染色分別對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌EHA105/pNULPGE04101以及對(duì)照EHA105/pBI121-PpXylM+XylA基因轉(zhuǎn)化后外植體形成的愈傷組織、不定芽和不定根等進(jìn)行觀察分析(圖9)。由于經(jīng)pNULPGE04101轉(zhuǎn)化后分化出的組織細(xì)胞活體可以利用熒光顯微鏡進(jìn)行判斷,特別是在愈傷組織階段,有熒光的部分切下繼續(xù)培養(yǎng),沒(méi)有熒光的部分淘汰,因此篩選比較有效。而pBI121-PpXylM+XylA轉(zhuǎn)化后分化出的愈傷組織經(jīng)GUS染色后細(xì)胞即失去活性。檢測(cè)結(jié)果顯示,pNULPGE04101的基因轉(zhuǎn)化效率(PCR陽(yáng)性植株/外植體×100%)為29%,明顯高于pBI121-PpXylM+XylA的基因轉(zhuǎn)化效率7%。

3 討論

本研究利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的pKAFCR1和pKAFCR100兩種質(zhì)粒[8],經(jīng)改造構(gòu)建了一個(gè)用于植物基因表達(dá)載體構(gòu)建的質(zhì)粒載體pNULPGE200。利用該質(zhì)粒載體構(gòu)建植物基因表達(dá)載體,具有簡(jiǎn)便和高效等優(yōu)點(diǎn)。

pNULPGE200質(zhì)粒因?yàn)橐肓酥参锘虮磉_(dá)最常用的35S啟動(dòng)子和NOS終止子,以及之間的多個(gè)克隆酶切位點(diǎn) MCS(HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI),克服了目前常用于植物基因表達(dá)載體構(gòu)建的質(zhì)粒載體(如pBIN19[2]、pBI121[3]、pIG121-Hm[4]、pMSIsGFP[5]和 pCAMBIA 系列[6]等)的一些缺點(diǎn),包括:目的基因插入的多克隆酶切位點(diǎn)有限;上下游缺少目的基因獨(dú)立表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子,需要預(yù)先把目的基因克隆到一個(gè)過(guò)渡載體,連接上35S和NOS后再亞克隆到基因表達(dá)載體;操作麻煩等。對(duì)于本研究構(gòu)建的pNULPGE200質(zhì)粒,利用PCR等方法克隆得到的目的基因片段可直接連接到pNULPGE200的35S啟動(dòng)子與NOS終止子之間,從而構(gòu)建成為在植物體內(nèi)能夠獨(dú)立表達(dá)的載體。由于pNULPGE200質(zhì)粒的 MCS 既有粘性末端(PacI、XmaI、KpnI、XhoI和SacI)也有平滑末端(HpaI、SmaI和StuI)酶切位點(diǎn),目的基因在PCR擴(kuò)增(或人工合成)時(shí),可以通過(guò)正反向引物的5′端(或兩端)分別引入這些粘性末端或平滑末端酶切位點(diǎn),與經(jīng)同樣酶切后的pNULPGE200進(jìn)行連接;或者利用有些DNA聚合酶(如Phusion高保真DNA聚合酶)在PCR擴(kuò)增后能夠產(chǎn)生平滑末端產(chǎn)物的特點(diǎn),可以直接與經(jīng)平滑末端酶切(HpaI、SmaI或StuI中一種)后的pNULPGE200進(jìn)行連接。

圖6 pNULPGE04101基因表達(dá)載體的T-DNA區(qū)段Fig.6 The T-DNA region of pNULPGE04101 gene expression vector

圖7 pBI121-PpXylM+XylA基因表達(dá)載體的T-DNA區(qū)段Fig.7 The T-DNA region of pBI121-PpXylM+XylA gene expression vector

圖8 矮牽?；蜣D(zhuǎn)化植株的PCR分析Fig.8 PCR analysis of transgenic P.hybrid plantlets

圖9 矮牽?；蜣D(zhuǎn)化植株的再生及各階段sGFP和GUS基因表達(dá)Fig.9 Regeneration of transgenic P.hybrid plants and monitoring of sGFP and GUS expressions at different developmental stages

另外,pNULPGE200還包含獨(dú)立表達(dá)的卡那霉素NPTⅡ耐性基因和sGFP綠色熒光蛋白報(bào)告基因,外植體經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的整個(gè)分化過(guò)程中,可以利用添加有卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,也可以利用熒光顯微鏡進(jìn)行判斷和觀察,篩選效果比較好。再者,pNULPGE200在目的基因插入的35S啟動(dòng)子和NOS終止子的上游和下游、NPTⅡ抗生素耐性基因和sGFP綠色熒光蛋白報(bào)告基因前后均有酶切位點(diǎn),可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇更合適的基因元件對(duì)其進(jìn)行更換。

為了驗(yàn)證所構(gòu)建的pNULPGE200質(zhì)粒的使用效果,我們以假單胞菌攜帶質(zhì)粒的二甲苯單加氧酶編碼基因PpXylM+XylA片段為材料,經(jīng)酶切后直接構(gòu)建了可用于植物基因轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體pNULPGE04101。與利用pBI121構(gòu)建植物基因表達(dá)載體需要克隆到一個(gè)過(guò)渡載體,然后再亞克隆相比,更簡(jiǎn)單高效。此外,該表達(dá)載體pNULPGE-04101經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化矮牽牛葉片后,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,其基因轉(zhuǎn)化效率也明顯高于由pBI121構(gòu)建的基因表達(dá)載體。

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