湯建軍 林晶晶 韓小樂 李恒平△

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，湖北 襄陽 441000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬襄陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 襄陽 441000）

急性胰腺炎（AP）是胰酶在胰腺內(nèi)被過早激活引起胰腺自身消化的急性炎癥反應(yīng)，輕者病情呈自限性且預(yù)后良好，約20%～30%患者可發(fā)展為重癥AP（SAP）［1-3］。 SAP 病情危重，進(jìn)展迅速，易造成患者多器官功能衰竭，經(jīng)積極治療病死率仍高達(dá)36%～50%。有研究顯示［4］AP期間胰腺細(xì)胞會(huì)發(fā)生自噬現(xiàn)象，調(diào)控自噬可能控制AP嚴(yán)重程度。Akt/mTOR（protein kinase B/mammalian target of rapamycin）通路是機(jī)體重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)［5］Akt/mTOR通路在炎癥反應(yīng)如膿毒血癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，抑制Akt/mTOR通路可減輕炎癥反應(yīng)。黃芩苷是從黃芩根中提取的黃酮類復(fù)合物，具有抗炎、利尿、抗變態(tài)等作用［6］。研究表明［7］黃芩苷可保護(hù)SAP時(shí)胰腺及其他臟器，但其具體保護(hù)機(jī)制尚未闡明。故本研究通過建立SAP大鼠模型，探究黃芩苷對(duì)SAP大鼠胰腺細(xì)胞自噬及Akt/mTOR通路的影響，以期為黃芩苷臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD健康雄性大鼠80只，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0008，于 20～25 ℃室溫、30%～70%相對(duì)濕度、自然光照下分籠飼養(yǎng)1周，自由飲水、進(jìn)食。

1.2 試藥與儀器 自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-LC3（漢恒生物科技上海有限公司），善寧注射液（醋酸奧曲肽注射液，北京百奧藥業(yè)有限責(zé)任公司），黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司），α-淀粉酶測(cè)定試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司），胰蛋白酶原激活肽（TAP）ELISA試劑盒（美國R△D公司），一抗羊抗鼠Akt、p-Akt單克隆抗體（美國 Santa Cruz公司），一抗兔抗鼠LC3-Ⅱ、mTOR、p-mTOR單克隆抗體（美國Abgent公司），二抗山羊抗兔IgG溶液（美國Sigma公司）。Biofuge 22R型高速低溫離心機(jī)（德國11ERAEUS公司），Leica-CM1950型恒冷切片機(jī)、Leica EG1160組織包埋機(jī)（德國徠卡公司）。

1.3 分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、善寧組和黃芩苷組各20只；每組又隨機(jī)分為3、6、12 h 3個(gè)亞組。所有大鼠均給予尾靜脈注射約2×109個(gè)自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3），于動(dòng)物房（室溫22～28℃，相對(duì)濕度40%～70%）中飼養(yǎng)1周。大鼠術(shù)前禁食12 h。先用3%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，備皮消毒，于右后肢腹股溝內(nèi)下方切開皮膚，游離右股靜脈，創(chuàng)建靜脈輸液通道。于大鼠腹部正中切口，暴露十二指腸乳頭處，用24號(hào)靜脈留置針穿透十二指腸外側(cè)壁，斜行進(jìn)入腸管，并經(jīng)十二指腸乳頭開口進(jìn)入膽胰管0.5～1.0 cm，退出針芯，同時(shí)用顯微血管鑷夾閉膽管出肝門處，以防藥物返流肝臟。將微量輸液泵與留置針末端相連，以0.2 mL/min逆行注入3.5%?；悄懰徕c（0.1 mL/100 g）。最后將顯微血管鑷與留置針移去，常規(guī)縫合傷口。假手術(shù)組大鼠僅開腹翻動(dòng)十二指腸與胰腺。造模后12 h，模型組、黃芩苷組大鼠各死亡1只，假手術(shù)組、善寧組大鼠均無死亡。

1.4 給藥方法 造模成功后10 min，善寧組大鼠向右股靜脈一次性推入善寧注射液2.5 μg/100 g，接著用微量輸液泵以速度 2.5 μg/（100 g·h） 連續(xù)靜脈輸入善寧注射液。黃芩苷組大鼠向右股靜脈一次性推入5%黃芩苷0.2 mL/100 g，接著用微量輸液泵以速度0.2 mL/（100 g·h）連續(xù)靜脈輸入5%黃芩苷。其余兩組大鼠給予等量生理鹽水。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血清淀粉酶和TAP含量測(cè)定。大鼠靜脈給藥3、6、12 h后開胸，在心臟中快速抽血2 mL，靜止1 h后，于4℃、3000 r/min條件下離心10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱。用α-淀粉酶測(cè)定試劑盒測(cè)定血清淀粉酶含量，用TAP ELISA試劑盒測(cè)定血清TAP含量。操作步驟參照試劑盒說明書。2）胰腺組織病理變化HE檢測(cè)。造模后于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死各組大鼠，收集胰腺組織，固定于4%多聚甲醛溶液中24～48 h；脫水后石蠟包埋；用組織切片機(jī)以5 μm厚度切片，60℃恒溫箱中烤片3～5 h；切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；蘇木精液染色5 min；水沖洗后75%鹽酸乙醇分化30 s；水沖洗、乙醇處理后酸化伊紅溶液染色2 min；乙醇脫水、二甲苯透明；用中性樹膠封片、烘烤過夜。用倒置相差顯微鏡觀察并拍照。由2位資深病理醫(yī)師用雙盲法閱片，根據(jù)Schmidt評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］，對(duì)胰腺水腫、壞死、出血、炎癥程度進(jìn)行綜合評(píng)分。3）胰腺腺泡細(xì)胞自噬免疫熒光觀察。將大鼠胰腺組織石蠟標(biāo)本用30%蔗糖脫水48 h，浸沒于適量OCT包埋劑中，液氮迅凍成塊，注意切勿浸入液氮內(nèi)。組織冰塊取出后用恒冷切片機(jī)以4～8 mm厚度冰凍切片。用0.5 mol/L Na2CO3-50%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。4）Western blot檢測(cè) LC3-Ⅱ、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)。將大鼠胰腺組織剪成碎片，加入適量蛋白緩沖液，按常規(guī)方法提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)好蛋白濃度。每組取50 μg蛋白樣品，與上樣緩沖液等體積混合；80V恒壓10%SDS-PAGE電泳30 min，100 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛出玻璃板底部時(shí)停止；轉(zhuǎn)至NC膜，于含5%脫脂奶粉TBST溶液中避光封閉1 h；將膜TBST漂洗后置于一抗稀釋液（Akt、p-Akt為 1∶200，LC3-Ⅱ、mTOR、p-mTOR 為 1∶300）中，4℃孵育過夜；次晨將膜TBST漂洗后置于二抗稀釋液（1∶3000）中，在搖床上室溫孵育 1 h；TBST 漂洗后滴加ECL發(fā)光液，曝光3次，選取重疊值。蛋白條帶灰度值用Image J軟件進(jìn)行分析。用β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用“率”描述，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶和TAP水平比較見表1。造模后3、6、12 h時(shí)間點(diǎn)，模型組、善寧組、黃芩苷組大鼠血清淀粉酶和TAP水平均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），善寧組、黃芩苷組大鼠血清淀粉酶和TAP水平均顯著低于模型組（P＜0.05），黃芩苷組大鼠血清淀粉酶和TAP水平均顯著低于善寧組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶和TAP水平比較（±s）

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清淀粉酶和TAP水平比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與善寧組比較，△P＜0.05。 下同。

血清淀粉酶（U/L） 血清 TAP（nmol/L）組 別 n 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h假手術(shù)組 6 1438.52±318.20 1503.63±328.36 1524.69±268.57 0.66±0.08 0.72±0.07 0.65±0.10模型組 6 4839.64±1164.51*5264.28±763.22* 6157.35±683.34* 4.28±0.38*5.51±0.41*5.90±0.46*善寧組 6 3638.57±598.22*#4256.32±615.29*#4986.38±582.15*# 3.54±0.29*#4.33±0.42*#5.06±0.37*#黃芩苷組 6 2831.26±629.83*#△ 3134.98±546.46*#△ 3564.55±635.74*#△ 2.86±0.43*#△ 3.58±0.34*#△ 4.34±0.46*#△

2.2 各組胰腺組織病理學(xué)檢測(cè) 見圖1，表2。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組可觀察到腺泡水腫，腺泡結(jié)構(gòu)遭受破壞，小葉間隔變寬，胰腺組織不同程度壞死、出血，病情隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加重；黃芩苷干預(yù)后大鼠胰腺組織損傷程度顯著降低。參照Schmidt評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，與假手術(shù)組相比，模型組、善寧組和黃芩苷組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織損傷病理學(xué)評(píng)分均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，善寧、黃芩苷干預(yù)后大鼠在各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織損傷病理學(xué)評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。與善寧組相比，黃芩苷干預(yù)后大鼠在各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織損傷病理學(xué)評(píng)分顯著較低（P＜0.05）。

圖1 造模后12 h各組胰腺組織（HE染色，100倍）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織損傷病理學(xué)評(píng)分比較（分，±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織損傷病理學(xué)評(píng)分比較（分，±s）

組 別 n 12 h 3 h 6 h假手術(shù)組 4 0.51±0.17模型組 4 10.23±0.81*善寧組 4 8.41±0.69*#0.53±0.16 0.48±0.13 6.03±0.96* 8.78±0.57*4.78±0.84*# 7.03±0.72*#黃芩苷組 4 6.24±0.52*#△3.06±0.73*#△ 4.96±0.64*#△

2.3 各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞自噬免疫熒光觀察 圖2熒光顯微鏡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠造模后3、6、12 h自噬流明顯增加，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)自噬流越來越強(qiáng)。圖3顯示造模后12 h，模型組、善寧組和黃芩苷組大鼠胰腺自噬流綠色熒光顯著強(qiáng)于假手術(shù)組；善寧、黃芩苷干預(yù)后大鼠胰腺自噬流綠色熒光顯著低于模型組；黃芩苷干預(yù)后大鼠胰腺自噬流綠色熒光顯著低于善寧組。

圖2 模型組造模后胰腺組織自噬流變化（100倍）

圖3 造模后12 h各組大鼠胰腺組織自噬流變化（100倍）

2.4 各組大鼠胰腺組織自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)比較 見圖4，表3。Western blot結(jié)果顯示，造模后12 h，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；善寧、黃芩苷干預(yù)后大鼠LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組和假手術(shù)組（P＜0.05）；黃芩苷干預(yù)后大鼠LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著低于善寧組（P＜0.05）。

圖4 Westernblot檢測(cè)造模后12h大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)

表3 造模后12 h各組大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)灰度值（±s）

表3 造模后12 h各組大鼠胰腺組織LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)灰度值（±s）

組 別 n LC3-Ⅱ假手術(shù)組 4模型組 4善寧組 4 0.241±0.009 0.382±0.023*0.236±0.014*#黃芩苷組 40.150±0.017*#△

2.5 各組大鼠胰腺組織 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)比較 見圖5、表4。造模后12 h各組Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與假手術(shù)組相比，模型組大鼠胰腺組織p-Akt、pmTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；善寧組、黃芩苷組大鼠p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.05）；黃芩苷組大鼠 p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平顯著低于善寧組（P＜0.05）。

圖 5 Western blot檢測(cè)大鼠胰腺組織 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)

3 討 論

牛黃膽酸鈉是膽汁的主要組分，向胰膽管注入該藥物后，可造成胰管膽汁返流，胰管上皮細(xì)胞遭受破壞，胰酶被誘導(dǎo)激活，導(dǎo)致SAP的發(fā)生［8-9］。本研究通過胰膽管逆行注射3.5%牛黃膽酸鈉的方法制備SAP模型，發(fā)現(xiàn)大鼠血清淀粉酶和TAP水平均顯著升高，且觀察到胰腺腺泡水腫、壞死、出血，說明SAP大鼠模型制備成功。

表4 各組大鼠胰腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)灰度值（±s）

表4 各組大鼠胰腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)灰度值（±s）

組別 n Akt p-Akt mTOR p-mTOR假手術(shù)組 6模型組 6善寧組 6 0.210±0.016 0.231±0.013 0.198±0.021 0.453±0.025*0.208±0.019 0.203±0.022#0.324±0.009 0.356±0.021 0.331±0.007 0.514±0.017*0.326±0.012 0.338±0.025#黃芩苷組 60.216±0.008 0.174±0.015*#△0.328±0.010 0.251±0.032**△

自噬是真核細(xì)胞特有的一種保護(hù)機(jī)制，可消化構(gòu)型異常的蛋白質(zhì)、多余或受損的細(xì)胞器，在細(xì)胞饑餓、損傷或其他不良環(huán)境下，生物體消化自身成分為細(xì)胞提供養(yǎng)分與能量［10-12］。自噬相關(guān)蛋白LC3在進(jìn)化中高度保守，為自噬體產(chǎn)生的標(biāo)志。LC3包括Ⅰ型與Ⅱ型，LC3-Ⅱ定位在自噬體膜的表面，參與自噬體的形成，常被用于衡量細(xì)胞自噬的程度［13-14］。本研究在造模前各組大鼠均給予尾靜脈注射自噬雙標(biāo)腺病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模后12 h模型組大鼠胰腺自噬流綠色熒光較假手術(shù)組顯著增強(qiáng)，胰腺組織LC3-Ⅱ表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著升高。這反映出SAP時(shí)胰腺腺泡細(xì)胞的自噬情況加重，表明自噬在AP發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。

全身炎癥反應(yīng)失控是引起SAP患者出現(xiàn)并發(fā)癥和死亡的重要原因［15］。中醫(yī)治療SAP主要湯藥有清胰湯、柴芩承氣湯，黃芩是其主要有效成分之一［16］。黃芩具有抗自由基、抗氧化以及抑制過氧化脂質(zhì)產(chǎn)生的功能。黃芪苷是黃芪根中的重要活性成分，黃芪苷可用于治療 SAP，以減輕胰腺炎癥反應(yīng)［17］。 研究發(fā)現(xiàn)［18-19］Akt/mTOR信號(hào)通路參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程，Akt作為一種絲蘇氨酸蛋白激酶，可協(xié)同磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1/2促進(jìn)三磷酸磷脂酰肌醇與其自身結(jié)合，Akt由胞漿轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜并發(fā)生磷酸化，被激活的Akt可活化下游蛋白mTOR。Akt/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、自噬等生理過程中發(fā)揮重要作用［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩苷組大鼠血清淀粉酶和TAP水平較模型組、善寧組均顯著降低，胰腺組織損傷程度明顯減輕，說明黃芩苷比善寧更能減輕SAP大鼠的病情；黃芩苷治療后大鼠胰腺自噬流綠色熒光較弱、胰腺組織LC3-Ⅱ表達(dá)水平顯著降低，表明黃芩苷治療比善寧更能緩解SAP大鼠胰腺細(xì)胞自噬程度；黃芩苷組大鼠胰腺組織p-Akt、p-mTOR表達(dá)水平較善寧組顯著降低，表明黃芩苷比善寧更能抑制Akt/mTOR信號(hào)通路。這些結(jié)果暗示黃芩苷可能通過抑制Akt/mTOR信號(hào)通路來減輕胰腺細(xì)胞自噬程度，且療效比善寧更好。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAP大鼠胰腺損傷組織中LC3-Ⅱ、p-Akt與p-mTOR表達(dá)水平顯著增加，黃芩苷治療后SAP大鼠胰腺水腫、壞死、出血程度明顯減輕，且大鼠胰腺損傷組織中LC3-Ⅱ、p-Akt與p-mTOR表達(dá)水平顯著降低，表明黃芩苷可能通過抑制Akt/mTOR信號(hào)通路來減輕胰腺細(xì)胞自噬程度，從而緩解SAP大鼠病情。

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