許硯秋 榮曉鳳

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400016）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種未見(jiàn)明確病因的炎癥性自身免疫性疾病，其病理特征為關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成、骨組織損傷，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫痛、僵硬、關(guān)節(jié)破壞，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)變形及功能障礙［1］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）、Akt是RA滑膜血管新生的重要調(diào)節(jié)因子，尤其PI3K/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路對(duì)RA的滑膜細(xì)胞增殖有重要作用。滑膜血管新生是造成RA關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要原因之一，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）主要作用于滑膜血管內(nèi)皮，增加RA微血管的通透性并刺激內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖，加重RA血管翳的新生和滑膜炎癥，因此通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt、抑制VEGF，影響滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡，就能控制滑膜炎癥、抑制骨破壞。所以針對(duì)該信號(hào)通路及細(xì)胞因子為靶點(diǎn)的藥物治療就成為了新的研究熱點(diǎn)。我們團(tuán)隊(duì)前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方大黃散外敷能明顯降低血清及踝關(guān)節(jié)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子，改善關(guān)節(jié)的病理學(xué)形態(tài)［2-3］，因此本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步觀察復(fù)方大黃散對(duì)RA患者的作用及對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路、VEGF的作用，為臨床上應(yīng)用復(fù)方大黃散治療RA提供更多的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 1）診斷標(biāo)準(zhǔn)：西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年ACR的RA分類評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)；中醫(yī)診斷參照《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》，符合痹證濕熱痹阻證型。2）納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2010年ACR和EULAR的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合上述中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；均使用甲氨蝶呤治療，劑量每周10 mg；對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程知情并同意參與研究，并簽署知情同意書(shū)。3）排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他風(fēng)濕免疫性疾病者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、ANCA相關(guān)性血管炎等；有嚴(yán)重的心血管、肝、腎、消化道、內(nèi)分泌等系統(tǒng)疾病者。

1.2 臨床資料 選取2016年5月至2017年8月入住重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科首次確診為RA的患者60例，按入院先后順序編號(hào)后隨機(jī)分為觀察組與對(duì)照組各30例。兩組病程、年齡、治療前血清學(xué)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.3 給藥方法 對(duì)照組采用甲氨蝶呤每周10 mg口服（2.5 mg/片，上海信誼生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)0361702202）；實(shí)驗(yàn)組采用甲氨蝶呤每周10 mg+復(fù)方大黃散外敷治療，復(fù)方大黃散由大黃、梔子、紅花按 1.2∶1.2∶1碾磨成粉后混勻，經(jīng)7號(hào)篩120目后加蒸餾水?dāng)嚢璩珊隣?，均勻敷布于紗布上，厚度約2 mm，覆蓋于患處約1 h，每天1次。所有中藥飲片由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，療程1個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo) 1）標(biāo)本采集：治療前和治療后分別采集患者血清。于清晨空腹采集患者5 mL血液，用不加抗凝劑的真空管抽取，常溫下靜置30 min后，用4℃離機(jī)，以3000 r/min離心10 min，抽取上清液，放于標(biāo)好號(hào)的EP管中，并用封口膠密封，保存于-80℃冰箱內(nèi)，以備集中檢測(cè)。2）關(guān)節(jié)疼痛評(píng)估：使用VAS評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0～10分。0分為無(wú)痛；3分以下為有輕微的疼痛，能忍受；4～6分為患者疼痛并影響睡眠，尚能忍受；7～10分為患者有逐漸強(qiáng)烈的難以忍受的疼痛感，影響食欲和睡眠。3）療效評(píng)分：根據(jù)歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）的療效評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以DAS28為標(biāo)準(zhǔn)，判斷RA患者疾病活動(dòng)度，△DAS28≥1.2，DAS28≤2.6 分，表明病情處于緩解期；△DAS28≥1.2，2.6分＜DAS28≤3.2分，表明病情處于輕度活動(dòng)期；△DAS28≥1.2，3.2分＜DAS28≤5.1 分，或 0.6＜△DAS28≤1.2，DAS≤5.1 分，則病情處于中度活動(dòng)期；△DAS28≥1.2，DAS28＞5.1分，說(shuō)明病情處于重度活動(dòng)期。4）血常規(guī)、肝功、腎功均由全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)得；免疫比濁法測(cè)定類風(fēng)濕因子（RF）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）；魏氏法測(cè)血沉（ESR）。 以上臨床指標(biāo)均由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科檢測(cè)。5）采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)抗CCP抗體、PI3K、AKT、VEGF，方法均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，試劑盒購(gòu)自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料正態(tài)分布以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，PI3K、AKT、VEGF水平與DAS28積分間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對(duì)照組1例患者失訪，共統(tǒng)計(jì)29例；觀察組統(tǒng)計(jì)30例。

2.1 兩組腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、VAS評(píng)分和DAS28評(píng)分比較 見(jiàn)表1。治療后兩組關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、VAS評(píng)分、DAS28評(píng)分較治療前均有顯著下降（P＜0.05），治療后觀察組腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、VAS評(píng)分、DAS28評(píng)分較對(duì)照組下降更明顯（P＜0.05）。

表1 兩組腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、VAS評(píng)分和DAS28 評(píng)分比較（±s）

表1 兩組腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、VAS評(píng)分和DAS28 評(píng)分比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，△P＜0.05。下同。

組 別 時(shí) 間 關(guān)節(jié)腫脹數(shù) 關(guān)節(jié)壓痛數(shù) VAS評(píng)分（分）DAS28評(píng)分（分）觀察組 治療前（n＝30） 治療后對(duì)照組 治療前13.87±4.83 12.40±5.53 4.72±1.58 6.43±0.60 4.23±2.73*△ 5.53±3.83*△ 1.52±1.21*△ 4.59±0.70*△13.07±4.32 11.80±4.23 4.80±1.38 6.25±0.57（n＝29） 治療后8.57±3.08* 6.90±3.62* 2.13±0.86* 5.39±0.55*

2.2 兩組血清CRP、ESR、RF、抗CCP抗體水平比較見(jiàn)表2。治療后，觀察組與對(duì)照組患者血清ESR、RF、抗CCP抗體均較治療前有下降，其中ESR、RF以觀察組下降最明顯（P＜0.05），對(duì)照組治療前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組CRP值治療前后有明顯下降（P＜0.05），而對(duì)照組CRP值無(wú)明顯下降。

表2 兩組治療前后血清CRP、ESR、RF、抗CCP水平比較（±s）

表2 兩組治療前后血清CRP、ESR、RF、抗CCP水平比較（±s）

組 別 時(shí) 間CRP（mg/L） ESR（mm/h）RF（IU/mL） 抗 CCP（U/mL）觀察組 治療前（n＝30）治療后對(duì)照組 治療前34.02±34.60 63±20 726±1040 724±636 13.89±21.79* 46±26* 103±165* 720±758 27.78±29.81 56±23 418±646 688±602（n＝29）治療后35.56±62.66 47±21 162±116 528±525

2.3 兩組血清PI3K、Akt、VEGF水平比較 見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)組治療后PI3K、Akt、VEGF水平均較治療前下降，其中Akt差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組治療后PI3K、Akt水平較治療前有所下降，但并無(wú)明顯差異（P＞0.05），治療后觀察組VEGF、Akt水平比對(duì)照組低，其中Akt水平的下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 兩組血清 PI3K、Akt、VEGF 水平比較（±s）

表3 兩組血清 PI3K、Akt、VEGF 水平比較（±s）

組 別 時(shí) 間 VEGF（pg/mL）PI3K（pmol/L） Akt（ng/mL）觀察組 治療前 495±560（n＝30） 治療后 274±212對(duì)照組 治療前 480±650 35±14 47.5±25.1 34±13 23.2±7.3*△35±12 43.4±16.0（n＝29） 治療后 647±590 27±7 40.0±8.0

2.4 不良反應(yīng) 治療后實(shí)驗(yàn)組有2例出現(xiàn)白細(xì)胞減少（白細(xì)胞計(jì)數(shù)：2.6～3.2×109/L）。治療后對(duì)照組有2例出現(xiàn)白細(xì)胞減少，此例患者治療前白細(xì)胞水平已低于正常值。觀察組和對(duì)照組均未見(jiàn)肝腎功能損害。觀察組有1例11 d后在敷藥部位出現(xiàn)皮膚輕微瘙癢發(fā)紅，局部無(wú)腫脹破潰，經(jīng)對(duì)癥處理后均好轉(zhuǎn)。

3 討 論

RA是一種累積關(guān)節(jié)滑膜組織，導(dǎo)致骨破壞的慢性自身免疫性疾病。其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎、血管翳形成，并受信號(hào)通路、細(xì)胞因子等多種因素調(diào)節(jié)，其中與PI3K/Akt信號(hào)通路、VEGF密切相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路有抗成纖維滑膜細(xì)胞凋亡并引起其異常增殖的作用，有研究顯示RA患者滑膜細(xì)胞中Akt存在過(guò)度表達(dá)，PI3K能夠活化Akt，而Akt能磷酸化多種靶蛋白產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的效應(yīng)［4-5］，所以通過(guò)抑制異常活化的PI3K/Akt通路可以誘導(dǎo)類風(fēng)濕成纖維滑膜樣細(xì)胞的凋亡，抑制滑膜增殖，控制RA病情活動(dòng)。另外在RA中，VEGF也有抗滑膜血管翳細(xì)胞凋亡的作用，并能促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增生。其通過(guò)與VEGF受體（VEGFR）結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、分化和增加血管通透性，從而促進(jìn)血管翳的形成和炎癥反應(yīng)的發(fā)生［6］。所以抑制PI3K/AKT信號(hào)通路、VEGF的生成，就成為RA治療的切入點(diǎn)。

治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物包括非甾體抗炎藥（NSAIDS）、改善病情的抗風(fēng)濕藥（DMARDS）、糖皮質(zhì)激素、生物制劑、靶向小分子藥物以及植物藥［7-8］。非甾體抗炎藥在關(guān)節(jié)疼痛急性期起到了很好的作用，通過(guò)抑制環(huán)氧化酶的活性，減少炎癥因子前列腺素的合成，抑制炎癥反應(yīng)。但長(zhǎng)期服用易引起上消化道出血、肝腎功能不良等。DMARDS作為RA基礎(chǔ)用藥，能延緩關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進(jìn)展，但對(duì)RA急性期的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹無(wú)明顯改善。常用的DMARDS藥物有：來(lái)氟米特、甲氨蝶呤、羥氯喹等。而糖皮質(zhì)激素相較于DMARDS，不僅能延緩病情進(jìn)展，還能通過(guò)基因調(diào)節(jié)機(jī)制減少促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，從而緩解關(guān)節(jié)疼痛。所以常與DMARDS聯(lián)合使用，但糖皮質(zhì)激素有引起骨質(zhì)疏松、誘發(fā)加重感染及消化系統(tǒng)疾病等不良反應(yīng)，停用后病情常反復(fù)。故針對(duì)緩解關(guān)節(jié)疼痛、預(yù)防骨破壞的生物制劑就成為RA治療的一大突破，但其價(jià)格相對(duì)昂貴，是傳統(tǒng)DMARDS療效不佳的后備藥物［9］。而植物藥既能抗炎、改善關(guān)節(jié)疼痛，又具備免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，但其有肝腎毒性、對(duì)生殖系統(tǒng)有不良反應(yīng)［7，10-11］。近年來(lái)靶向小分子藥物成為研究熱點(diǎn)，如：JAK/STAT信號(hào)通路抑制劑通過(guò)阻斷細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)放大作用，改善RA受損關(guān)節(jié)癥狀，但其有嚴(yán)重感染、誘發(fā)惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。因此，選擇安全有效的抗風(fēng)濕藥成為醫(yī)者關(guān)注的重點(diǎn)。

中醫(yī)藥有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)作用，近年來(lái)在RA的治療中占有很重要的地位。RA屬中醫(yī)痹證范圍?！帮L(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹”是《黃帝內(nèi)經(jīng)》最早提出的致病病因。風(fēng)寒濕入侵，久則化熱，瘀阻經(jīng)絡(luò)，致關(guān)節(jié)反復(fù)腫痛，最終引起畸形。因此“濕熱瘀阻筋脈”是RA急性期關(guān)節(jié)腫痛的主要病機(jī)特點(diǎn)，治宜清熱除濕、通絡(luò)止痛。復(fù)方大黃散是我們長(zhǎng)期臨床實(shí)踐篩選出的外敷治療RA的有效經(jīng)驗(yàn)方，由大黃、梔子、紅花組成?，F(xiàn)代文獻(xiàn)無(wú)大黃治療RA的報(bào)道，但早在《圣惠》記載的“大黃散”“大黃飲子”及《三因極·病證方論》卷三記載的“大黃左經(jīng)湯”等方，均以大黃為主藥，治療“肢節(jié)煩疼”“腰腳痹痛”等。因此以大黃為君，逐瘀通經(jīng)、清熱瀉火；梔子為臣，涼血散瘀、清熱利濕；紅花為佐，活血通經(jīng)，祛瘀止痛。諸藥相配，共成清熱除濕、活血止痛之效。有文獻(xiàn)報(bào)道，大黃中的有效成分主要為大黃素，且能降低VEGF的水平［12］。梔子的有效成分梔子總苷可抑制早期炎癥的滲出和水腫，增加抗炎鎮(zhèn)痛作用［13］。紅花能明顯改善機(jī)體的免疫功能，并且有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用［14］。前期研究已證實(shí)復(fù)方大黃散能使佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹明顯緩解，血清及踝關(guān)節(jié)TNF-α水平明顯下降，作用與外敷扶他林效果相當(dāng)，比口服藥物更安全［15］。表明該方藥對(duì)RA大鼠有良好抗炎消腫、抑制致炎因子的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，外敷復(fù)方大黃散聯(lián)合甲氨蝶呤治療RA患者1個(gè)月后，較單純口服甲氨蝶呤的患者在關(guān)節(jié)疼痛數(shù)量、腫脹數(shù)量、疼痛程度上改善效果更佳；VAS評(píng)分、DAS28評(píng)分及ESR、RF、CRP水平均較治療前明顯下降，再次證實(shí)了復(fù)方大黃散能明顯減輕RA患者關(guān)節(jié)腫脹疼痛，控制RA炎癥活動(dòng)，聯(lián)合DMARDs能縮短病程，起到協(xié)同增效之功。

觀察結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組患者血清PI3K、Akt、VEGF水平較治療前降低，說(shuō)明外敷復(fù)方大黃散在一定程度上通過(guò)透皮吸收可能抑制PI3K/Akt信號(hào)通路及VEGF表達(dá)，從而抑制RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥。本研究首次證實(shí)了復(fù)方大黃散聯(lián)合甲氨蝶呤相比于單用甲氨蝶呤對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路有更大的影響，同時(shí)也說(shuō)明了復(fù)方大黃散能降低VEGF的水平。另一方面，本研究實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組治療后Akt水平有顯著差異，但PI3K水平并未見(jiàn)明顯差異，提示復(fù)方大黃散的作用靶點(diǎn)可能在Akt，但另一種可能為本觀察周期短、樣本量不足，有待今后進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)復(fù)方大黃散存在血常規(guī)、肝功損害等安全性問(wèn)題，和前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，口服傳統(tǒng)DMARDS聯(lián)合外敷復(fù)方大黃散，對(duì)關(guān)節(jié)紅腫熱痛有較好抗炎止痛作用，并能有效降低血清PI3K、Akt、VEGF濃度，且無(wú)明顯不良反應(yīng)。表明甲氨蝶呤聯(lián)合復(fù)方大黃散外敷，能顯著改善RA患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹癥狀，對(duì)患者關(guān)節(jié)炎癥起到很好的抑制作用。其作用機(jī)制之一可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路及VEGF表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)于RA急性發(fā)作時(shí)的治療提出了一條新的思路。

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