黃國(guó)林，滕翠芳，羅燕妹，覃貴慧，駱敏，陽(yáng)潔

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021)

我國(guó)是全球肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一，我國(guó)的肝癌發(fā)病人數(shù)約占全球的55%。70%～90%的原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞肝癌(HCC)。手術(shù)切除是HCC首選治療方法，術(shù)后高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率是導(dǎo)致HCC患者死亡的主要原因[1]。目前HCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制尚未完全明確。Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Rac1)是Rho樣小GTP酶家族中的一員，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用[2]。最新研究[3, 4]發(fā)現(xiàn)，Rac1與HCC的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在乳腺癌、大腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有雙重作用，既可作為腫瘤促進(jìn)因子也可作為腫瘤抑制因子[5]。目前Rac1與TGF-β1在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制仍不明確。我們觀察了HCC組織中Rac1、TGF-β1的表達(dá)變化，并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年11月～ 2013年4月間廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的HCC患者73例，其中男64例、女9例；年齡14 ～ 73歲，中位年齡46歲；據(jù)TNM分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ級(jí)30例、Ⅱ級(jí)15例、Ⅲ級(jí)28例；25例存在HCC轉(zhuǎn)移。均行HCC切除術(shù)，術(shù)中保留HCC組織及相應(yīng)的癌旁組織(距離癌灶>2 cm處的肝組織)，術(shù)后病理顯示73例份癌旁組織中18例為肝硬化、55例為正常肝組織，全部標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、常規(guī)石蠟包埋后作4 mm連續(xù)切片。

1.2 試劑 兔抗人Rac1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Signalway Antibody(SAB)公司；鼠抗人TGF-β1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；HRP鼠兔通用型二抗購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 HCC癌組織及癌旁正常組織Rac1、TGF-β1檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)HCC癌組織、癌旁正常組織Rac1、TGF-β1?？筊ac1多克隆抗體及抗TGF-β1單克隆抗體均按1：100稀釋。陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。切片常規(guī)脫蠟至水，以檸檬酸液(pH 6.0)作為修復(fù)液，用高壓鍋熱壓修復(fù)抗原3 min， 過(guò)氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%)處理10 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗后加一抗于37 ℃孵育1.5 h，PBS沖洗后加二抗于37 ℃孵育30 min，加DAB工作液顯色后用蘇木素染色1 min、鹽酸酒精脫水透明、晾干封片后在光鏡下觀察。每張切片在光鏡下取10個(gè)具有代表性的視野，每張切片均由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)：Rac1和TGF-β1陽(yáng)性染色均為在細(xì)胞質(zhì)中有黃色顆粒沉著。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)的染色程度以及染色細(xì)胞的百分率來(lái)進(jìn)行評(píng)分[6, 7]：基本不著色者計(jì)0分，淡黃色者計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕黃色或棕褐色計(jì)3分；Rac1染色細(xì)胞百分率<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；TGF-β1染色細(xì)胞百分率0%計(jì)0分，<10%計(jì)1分，10%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。將每張切片染色程度得分與染色細(xì)胞率得分相乘即為最終分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)≤3視為低表達(dá)，>3視為高表達(dá)。計(jì)算Rac1、TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)率(陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)/總例數(shù))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行作圖，所得半定量資料用χ2檢驗(yàn)，兩兩之間相關(guān)分析用Spearman 相關(guān)性分析檢驗(yàn)，用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析Rac1和TGF-β1共同高表達(dá)與HCC預(yù)后的相關(guān)性并用log-rank法進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HCC組織、癌旁正常組織Rac1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為37.0%(27/73)、20.5%(15/73),二者比較，P<0.05；HCC組織、癌旁正常組織TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.6%(45/73)、28.8%(21/73)，二者比較，P<0.05。

Rac1、TGF-β1表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。Rac1或TGF-β1的表達(dá)與HCC患者年齡、性別、Edmondson-Steiner分級(jí)、肝硬化、腫瘤囊狀浸潤(rùn)、腫瘤結(jié)節(jié)、血管侵襲及乙肝表面抗原等臨床病理特征均無(wú)關(guān)(P>0.05)。HCC組織TGF-β1的表達(dá)與腫瘤直徑、血清甲胎蛋白表達(dá)、門(mén)靜脈癌栓、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)Rac1與TGF-β1在HCC中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.313，P<0.01)，與單獨(dú)高表達(dá)Rac1或TGF-β1相比，Rac1與TGF-β1的共同高表達(dá)與HCC 的TNM分期及轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=12.244，P<0.01；χ2=8.318，P<0.01)。

表1 Rac1和TGF-β1表達(dá)與 HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

本研究對(duì)35例HCC患者進(jìn)行隨訪(fǎng)。kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，單獨(dú)高表達(dá)Rac1或TGF-β1的患者與單獨(dú)低表達(dá)Rac1或TGF-β1的患者的中位生存期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)；共同高表達(dá)Rac1與TGF-β1的患者較共同低表達(dá)Rac1與TGF-β1的患者中位生存期短(χ2=6.225，P<0.05)，另外， Rac1與TGF-β1共同高表達(dá)的患者和單獨(dú)高表達(dá)Rac1或TGF-β1的患者的中位生存期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

3 討論

Rho樣小GTP酶家族中的Rac1與HCC的發(fā)展密切相關(guān)。負(fù)性調(diào)節(jié)Rac1活性及其表達(dá)，可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡，顯著抑制HCC生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[8]，并且HCC細(xì)胞核中過(guò)表達(dá)的Rac1與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)[3]。反之，異常高表達(dá)Rac1能夠促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲和遷移[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，Rac1主要表達(dá)于HCC組織的細(xì)胞漿，且其表達(dá)顯著高于癌旁組織，提示胞質(zhì)中高表達(dá)的Rac1可能與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)，我們將Rac1表達(dá)與患者臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，Rac1在晚期、有轉(zhuǎn)移的HCC組織中的表達(dá)明顯高于早期、無(wú)轉(zhuǎn)移的HCC組織。這些結(jié)果表明，HCC胞質(zhì)中高表達(dá)的Rac1與HCC TNM分期以及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

TGF-β1是TGF-β家族中分布最廣泛且含量最豐富的亞型，研究[10]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有促瘤和抑瘤的雙重作用，在腫瘤早期TGF-β1可作為一個(gè)腫瘤抑制因子，起到抑制腫瘤進(jìn)展的效果，而在腫瘤晚期，TGF-β1則具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。另外有研究[11]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在HCC組織的表達(dá)明顯高于正常肝組織，聯(lián)合TGF-β1和ELF檢測(cè)可有效地進(jìn)行HCC的預(yù)后評(píng)估。此外，有研究[12]表明，TGF-β1促進(jìn)HCC進(jìn)展的機(jī)制為促進(jìn)腫瘤EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

TGF-β1與Rac1兩者表達(dá)呈正相關(guān)；與單獨(dú)高表達(dá)Rac1或TGF-β1相比，Rac1與TGF-β1共同高表達(dá)與HCC 的TNM分期及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Rac1與TGF-β1共同高表達(dá)的患者比共同低表達(dá)的患者其復(fù)發(fā)時(shí)間更短。這些結(jié)果表明，HCC胞質(zhì)中共同高表達(dá)的Rac1和TGF-β1與HCC的惡性進(jìn)展及不良預(yù)后呈正相關(guān)。但目前，Rac1與TGF-β1在HCC中共同高表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。Rac1可間接上調(diào)腫瘤細(xì)胞的TGF-β1表達(dá)。Rac1激活Smad2信號(hào)通路從而上調(diào)TGF-β1介導(dǎo)的促腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用，促進(jìn)胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13]。另一方面，TGF-β1也可間接誘導(dǎo)或激活腫瘤細(xì)胞的Rac1表達(dá)。Binker 等[14]發(fā)現(xiàn)，在人胰腺癌細(xì)胞中，TGF-β1可直接激活Rac1/ROS/NF-κB信號(hào)通路從而誘導(dǎo)Rac1的表達(dá)。Hubchak 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在人腎系膜細(xì)胞中，Rac1可以通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路激活TGF-β1，并且用TGF-β1處理人腎系膜細(xì)胞5 min后可直接激活Rac1。外加TGF-β1刺激人肝星狀細(xì)胞LX-2可以促進(jìn)Rac1的表達(dá)，同時(shí)外加SMA則可以抑制這一作用[16]。提示Rac1與TGF-β1之間存在互相調(diào)控的關(guān)系。據(jù)此我們推測(cè)，Rac1與TGF-β1可能通過(guò)Smad2[13]、ROS/NF-κB[14]、PI3K/Akt[15]等一些信號(hào)通路而互相激活，從而共同參與HCC惡性進(jìn)展。但兩者之間具體的分子調(diào)控機(jī)制及與HCC進(jìn)展之間的關(guān)系，還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，HCC組織中Rac1、TGF-β1均呈高表達(dá)。Rac1、TGF-β1共同高表達(dá)與HCC的進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)。。

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