袁明明，任曉燕，謝慧君，王偉偉

(1南通市婦幼保健院，江蘇南通226006；2南通瑞慈醫(yī)院)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是發(fā)生在肝細(xì)胞與肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全世界腫瘤中居第六位，其病死率在腫瘤中居第二位[1]，江蘇南通地區(qū)的啟東市是世界衛(wèi)生組織確定的HCC高發(fā)研究現(xiàn)場(chǎng)。Toll樣受體3(TLR3)是Toll樣受體(TLRs)家族的一個(gè)重要成員，是病毒雙鏈RNA(dsRNA)識(shí)別受體。其基因定位于染色體4q35，分子量為117 kDa，其分子結(jié)構(gòu)的主要特征是存在高度保守的toll同源區(qū)。在人類癌腫中觸發(fā)TLR3信號(hào)通路主要偏向?qū)е录?xì)胞凋亡[2]。目前關(guān)于TLR3在HCC組織中表達(dá)情況的相關(guān)報(bào)道較少。本研究觀察了HCC組織中TLR3的表達(dá)變化，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取南通瑞慈醫(yī)院2007年1月～2012年12月間經(jīng)手術(shù)切除的HCC患者85例，其中男70例、女15例，年齡19～81歲，平均52.6歲；術(shù)前均未接受放療、化療或生物等治療，均經(jīng)病理檢查證實(shí)為HCC。術(shù)中均留取HCC癌組織及癌旁組織(距腫瘤2～3 cm)處的正常組織標(biāo)本，常規(guī)10%中性福爾馬林液固定、石蠟包埋以及4 μm切片，備用。

1.2 HCC癌組織及癌旁組織TLR3檢測(cè)方法 采用SP免疫組化染色法。兔抗人TLR3購(gòu)自ABCAM公司。切片脫蠟水化，制成4 μm厚連續(xù)切片；抗原熱修復(fù)處理，入Citrate檸檬酸抗原修復(fù)液(0.01 mol/L，pH6.0)，微波高火煮沸10 min；室溫自然冷卻，入內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑10 min；PBS沖洗3次，分別加入單抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min； PBS液沖洗3次，加二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸顯色。TLR3陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比測(cè)算TLR3陽(yáng)性表達(dá)率。無(wú)明顯陽(yáng)性細(xì)胞為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<50%為低表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥50%為高表達(dá)。

1.3 隨訪方法 術(shù)后隨訪至2017年10月，隨訪方法采用門診復(fù)診和電話隨訪；隨訪內(nèi)容包括一般情況、AFP、肝臟B超或CT、HCC是否復(fù)發(fā)等。HCC復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：B超或CT發(fā)現(xiàn)肝臟實(shí)性占位，并參考同期AFP檢測(cè)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用雙側(cè)χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。對(duì)有隨訪結(jié)果的病例單因素分析用Log-Rank檢驗(yàn)并做出Kaplan-Meier生存曲線。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HCC癌組織及癌旁組織TLR3的陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.8%(50/85)、71.8%(61/85)，二者比較，P<0.05。

TLR3表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，TLR3表達(dá)與HCC分化程度、TNM分期、復(fù)發(fā)有關(guān)(P均<0.01)，與HCC患者年齡、性別、HBsAg感染、血清AFP水平、有無(wú)肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及有無(wú)脈管侵犯無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

表1 TLR3表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

85例患者隨訪率89.4%(76/85)，隨訪時(shí)間1～96個(gè)月，平均26個(gè)月，隨訪頻率1次/3～4月，其中36例術(shù)后復(fù)發(fā)，43例無(wú)復(fù)發(fā)。共有72例死亡，71例死于HCC，1例死于其他因素?；颊?、3、5年總生存率(OS)分別為56.6﹪(43/76)、27.6﹪(21/76)、10.5﹪(8/76)。TLR3陰性、低表達(dá)及高表達(dá)者五年OS分別為0、4.5%(1/22)、25.0%(7/28)，兩兩比較，P均<0.05，見(jiàn)圖1。

圖1 HCC患者的生存曲線

3 討論

HCC是由肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞起源的惡性腫瘤，目前雖然HCC病因尚未完全明確，但目前公認(rèn)的三大危險(xiǎn)因素(病毒性肝炎、飲用水污染和黃曲霉毒素)均可導(dǎo)致體內(nèi)長(zhǎng)期慢性的炎癥過(guò)程，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。而作為全球最具威脅性的傳染性病原體之一的HBV病毒，是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化及HCC的主要因素。早期手術(shù)切除是HCC目前唯一有效的治療方法，化療和放療大多不能取得滿意效果，因此，分子靶向治療在HCC治療中的研究已經(jīng)迫在眉睫。

TLR3作為先天性免疫反應(yīng)受體Toll樣受體家族的一員，通過(guò)識(shí)別高度保守的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs) 來(lái)介導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。參與炎性細(xì)胞因子的釋放，并誘導(dǎo)宿主初始的抗細(xì)菌及抗病毒反應(yīng)。TLR3激動(dòng)劑的應(yīng)用不僅能夠促進(jìn)先天性免疫反應(yīng)，還可增強(qiáng)抗體依賴性效應(yīng)功能及適應(yīng)性免疫反應(yīng)。TLR3可能成為治療某些癌癥的關(guān)鍵性靶點(diǎn)。TLR3已被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌及黑色素瘤中均可表達(dá)，但其相關(guān)作用機(jī)制并未完全闡明[3～5]。在HCC中，TLR3被認(rèn)為可能是其通過(guò)下游分子諸如caspases、INF-γ或者NF-κB等來(lái)影響腫瘤的血管生成及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或擴(kuò)散等關(guān)鍵過(guò)程[4]。Yoneda等[5]證明TLR3表達(dá)于HCC細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)，52.7%的肝細(xì)胞癌組織切片呈TLR3陽(yáng)性。細(xì)胞質(zhì)中TLR3可能參與了細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞表面的TLR3則誘導(dǎo)激活了其下游的NF-κB途徑。由dsRNA激活的TLR3直接抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)HCC腫瘤細(xì)胞TLR3高表達(dá)的患者，其平均生存期高于低表達(dá)的患者，證實(shí)了TLR3通路的激活在腫瘤微環(huán)境中的作用。TLR3在HCC中的表達(dá)與細(xì)胞凋亡及血管生成存在密切關(guān)系，提示TLR3的下調(diào)使控制細(xì)胞增殖和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的生理性生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂，從而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[8]。Eiró等[9]發(fā)現(xiàn)TLR3在HCC細(xì)胞的表達(dá)與HCC腫瘤大小有關(guān)，而腫瘤大小是公認(rèn)的HCC預(yù)后最重要的指標(biāo)。最近也有學(xué)者[10]證實(shí)TLR3基因的多態(tài)性+1234 C/T與HCC的易感性有關(guān)，基因多態(tài)性可能是HCC一種新的危險(xiǎn)因素，尤其是HBV相關(guān)的HCC。

HCC病死率位居全世界腫瘤中第二位。近年來(lái)歸因于更好的治療方案及監(jiān)測(cè)方法，HCC患者5年OS有所提高，發(fā)達(dá)國(guó)家更是達(dá)到17.0%[11]。TLR3激動(dòng)劑也是有效的免疫佐劑，并且已經(jīng)在癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮較好效果。TLR3作為一種靶向治療癌癥的新型分子，目前已經(jīng)得到了重新認(rèn)識(shí)。TLR3其合成的配體poly(I:C)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12,13]。另一種TLR3 dsRNA激動(dòng)劑BM-06也能夠抑制HCC腫瘤的生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞的增殖，并且優(yōu)于poly(I：C)[14]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC癌組織中TLR3的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁正常肝組織，表明HCC癌組織中存在TLR3的表達(dá)下調(diào)。通過(guò)比較HCC中TLR3表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)在HCC低分化程度、TNM高分期及腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)，TLR3表達(dá)水平均下降，表明了TLR3對(duì)HCC發(fā)生、進(jìn)展發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。高表達(dá)TLR3的HCC患者臨床預(yù)后較好，其可作為HCC患者預(yù)后良好的判斷因子。

綜上所述，HCC癌組織TLR3表達(dá)降低，TLR3可能參與了HCC的發(fā)生、發(fā)展。

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