王鑫朋，孫二琳，張東正，趙坤，劉春雨，劉利維

(1 滄州市中心醫(yī)院，河北滄州061001；2 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

間質(zhì)性膀胱炎(IC)是指在膀胱鏡下具有典型的膀胱點狀出血、膀胱壁 Hunner 潰瘍及相關(guān)組織學(xué)特征的一種疾病[1]。IC的主要的病理生理變化為肥大細(xì)胞在膀胱黏膜下層及膀胱肌層的活化和聚集[2]。多數(shù)學(xué)者[3]認(rèn)為IC的發(fā)病機制是“肥大細(xì)胞假說”，但其具體發(fā)生機制目前尚不明確。肥大細(xì)胞被激活后脫顆?？舍尫沤M胺、5-羥色胺、類胰蛋白酶等多種活性物質(zhì)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)又稱單核細(xì)胞趨化和激活因子，屬于C-C亞族(β亞族)成員，起初是從人髓樣單核細(xì)胞系THP-1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及脂多糖(LPS)或PHA刺激的人外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)。研究[4]發(fā)現(xiàn)，MCP-1對單核細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞有趨化作用，能使嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒。趨化因子受體2(CCR2)是肥大細(xì)胞表面MCP-1受體，MCP-1可與CCR2發(fā)生特異性結(jié)合[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，IC患者尿液和膀胱組織中MCP-1的水平和表達(dá)均升高，但具體機制尚不明確。2016年6月～2017年1月，我們觀察了腹腔注射CCR2抑制劑RS102895、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉對小鼠IC的預(yù)防作用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、實驗動物、試劑及儀器 趨化因子受體CCR-2抑制劑RS102895購自Tocris公司，肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉購自美國Sigma公司。4～6周齡BALB/c雌性小鼠36只，體質(zhì)量17～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，LPS購自美國Sigma公司，硫酸魚精蛋白(PS)購自美國Sigma公司，MCP-1 ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，組胺ELISA試劑盒購自Abvona公司，酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 小鼠分組、給藥方法 36只雌性BALB/c小鼠采用隨機數(shù)字表法分為A、B、C、D組，每組9只。A、B、C組制作小鼠IC模型：0.06 mL/10 g的劑量腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉滿意后排空膀胱，繼續(xù)膀胱灌注50 g/L PS(約0.1 mL)，在膀胱內(nèi)保留45 min，再次排空膀胱，生理鹽水沖洗3次，灌注750 μg/mL的 LPS溶液并保留30 min，再次排空膀胱；每隔7天灌注1次，共灌注3次。A組首次膀胱灌注后1.5 h即按照5 mg/kg腹腔注射RS102895，1次/d,共注射21 d；B組首次膀胱灌注前2天即開始腹腔內(nèi)注射色甘酸鈉溶液50 mg/kg，1次/d,共注射23 d；C組每日注射等體積PBS溶液，共注射21 d。D組為空白對照。首次膀胱灌注記為第1 d第5 d使用反射排尿法收集各組小鼠尿液；第22 d拉頸處死各組小鼠，10%甲醛固定膀胱標(biāo)本，備用。

1.3 炎癥指標(biāo)觀察方法

1.3.1 各組膀胱組織黏膜和固有層炎性變化觀察 取各組膀胱組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，隨機選取5張切片行HE染色。顯微鏡下觀察膀胱組織黏膜和固有層炎性變化。

1.3.2 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細(xì)胞、脫顆粒細(xì)胞觀察 取各組膀胱組織，石蠟包埋后切片，行甲苯胺藍(lán)染色。隨機選取甲苯胺藍(lán)染色后的切片中的10個高倍視野，測算各組鏡下肥大細(xì)胞數(shù)、脫顆粒細(xì)胞百分比。

1.3.3 各組尿液MCP-1、組胺水平檢測 收集各組尿液，2 h內(nèi)分別用MCP-1、組胺ELISA試劑盒檢測尿液MCP-1、組胺，所有操作及樣本準(zhǔn)備均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測量其光密度值 (OD值)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測算各組尿液MCP-1、組胺含量。

2 結(jié)果

2.1 各組膀胱組織炎性變化 C組膀胱炎性反應(yīng)最重，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，膀胱黏膜上皮剝脫并可見組織水腫、充血；A、B組炎性反應(yīng)較輕，膀胱上皮相對完整；D組未見炎性細(xì)胞浸潤，膀胱上皮完整，見圖1。

2.2 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細(xì)胞計數(shù)、脫顆粒細(xì)胞百分比比較 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細(xì)胞計數(shù)、脫顆粒細(xì)胞百分比比較見表1。

2.3 各組尿液MCP-1、組胺比較 各組尿液MCP-1、組胺含量比較見表2。

3 討論

圖1 各組小鼠膀胱組織炎性變化(200×)

組別肥大細(xì)胞計數(shù)(個)脫顆粒肥大細(xì)胞百分比(%)A組3.44±1.24*#34.39±4.98*#B組2.78±1.39*#44.73±7.02*#C組16.33±3.57*83.96±6.56*D組1.44±0.8817.28±3.17

注：與D組比較，＊P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

表2 各組尿液MCP-1、組胺含量比較

注：與D組比較，＊P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

IC的發(fā)病機制目前尚不明確，女性發(fā)病率高于男性，癥狀反復(fù)發(fā)作、診斷困難及治療效果不佳是目前IC的治療難點。目前臨床主要以對癥治療為主[5]。肥大細(xì)胞作為一種重要的炎性細(xì)胞在各種生理病理過程中都發(fā)揮著重要作用，如過敏性哮喘、慢性胃炎、組織的損傷和修復(fù)等。IC的一個主要的病理生理學(xué)變化即為肥大細(xì)胞在膀胱黏膜下層及肌層的活化和聚集。眾所周知，肥大細(xì)胞可以被激活后脫顆粒釋放多種活性物質(zhì)，如組胺、5-羥色胺、類胰蛋白酶、前列腺素、白三烯、血小板活化因子和細(xì)胞因子等[7]，常見的誘發(fā)肥大細(xì)胞激活的因素有細(xì)菌、病毒的某些成分、干擾素等。有研究[8]表明大腸埃希菌屬的LPS 可以誘導(dǎo)肥大細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子、IL-6、IL-13、組胺等。

MCP-1可引起肥大細(xì)胞的聚集和激活，而且可以被單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。MCP-1與CCR2發(fā)生特異性的結(jié)合，此受體主要分布于單核細(xì)胞、髓樣前體細(xì)胞系和嗜堿性粒細(xì)胞中，屬于IL-8R家族[3]。MCP-1通過與相應(yīng)受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路， MCP-1活化的信號傳導(dǎo)路徑因細(xì)胞的類型而不同，而路徑的差別又可導(dǎo)致細(xì)胞趨化活性的不同。MCP-1通過與相應(yīng)的受體結(jié)合后發(fā)揮多種生物學(xué)功能。有學(xué)者[9]在IC的動物模型中發(fā)現(xiàn)，IC大鼠的膀胱和尿液中MCP-1蛋白明顯增多，肥大細(xì)胞表面MCP-1受體CCR2表達(dá)增加，并認(rèn)為CCR2受體可能成為一個潛在的IC治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，A組小鼠膀胱組織炎性反應(yīng)較輕，膀胱上皮相對完整。

色甘酸鈉作為一種肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑被偶然發(fā)現(xiàn)。它是一種色酮類化合物[10]，對平滑肌無直接松弛作用，對炎性介質(zhì)亦無拮抗作用，主要作用在于抑制抗原抗體結(jié)合后過敏性介質(zhì)的釋放。色甘酸鈉的藥理學(xué)機制主要是通過與肥大細(xì)胞膜上的鈣離子通道結(jié)合，這樣Ca2+的內(nèi)流受到抑制，從而使MCP-1、組胺、白三烯等多種炎性因子釋放減少[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，色甘酸鈉可以抑制大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒釋放炎性因子。盡管色甘酸鈉的治療效果在患者中有差異性，而且在哮喘的治療中只是起到輔助作用，但是還在諸如肥大細(xì)胞增多癥、過敏性結(jié)膜炎等疾病中有著不錯的治療效果。

雖然目前不能完全解釋肥大細(xì)胞為什么會在IC患者的膀胱中聚集、增殖以及活化脫顆粒，一種可能的解釋是損傷的尿路上皮細(xì)胞或者其他膀胱內(nèi)的細(xì)胞分泌趨化因子如MCP-1。這些趨化因子進(jìn)一步導(dǎo)致肥大的遷移以及活化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在環(huán)磷酰胺小鼠膀胱炎癥模型中，MCP-1在尿路上皮、固有層以及平滑肌表達(dá)升高，驗證了MCP-1對于肥大細(xì)胞的趨化作用，并且驗證了其對于肥大細(xì)胞的激活。本研究中，A組阻斷CCR2受體后，尿中組胺、MCP-1的含量較對照組明顯下降，因此我們推斷，在尿路上皮出現(xiàn)損傷后，釋放大量的活性因子，結(jié)果引起肥大細(xì)胞的聚集和活化，脫顆粒釋放更多的細(xì)胞因子和炎性因子。這些炎性介質(zhì)進(jìn)一步引起肥大細(xì)胞的聚集和加重膀胱組織的損傷，從而形成惡性循環(huán)。而且在使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉治療IC小鼠后，有效緩解小鼠膀胱的炎癥水平。

綜上所述，RS102895、色甘酸鈉均可減輕IC模型小鼠的炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與MCP-1通過與肥大細(xì)胞結(jié)合、促進(jìn)組胺釋放有關(guān) 。但其具體作用機制仍需進(jìn)一步研究。

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