張夢薇，羅昭遜，孫朝琴，張姝，莫非，江明禮

(貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，貴陽550004)

自1983年Marshal和Warren首次從慢性胃炎患者體內分離出幽門螺桿菌以來，國內外醫(yī)學領域已經(jīng)公認幽門螺桿菌是慢性活動性胃炎的一個主要致病菌[1]。目前廣泛應用的根除幽門螺桿菌的一線方案有標準三聯(lián)療法(PPI+克拉霉素+阿莫西林)或四聯(lián)療法(PPI+克拉霉素+阿莫西林+鉍劑)，但幽門螺桿菌的耐藥問題是治療根除失敗的最主要原因[2]。目前徹底根除幽門螺桿菌仍是目前的研究熱點。苗藥頭花蓼為蓼科蓼屬草本植物并含有黃酮醇及其苷類成分，可抑制革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌的生長。蛋白激酶B(AKT)、抑癌基因p53、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)是細胞凋亡調控基因，其異常表達可促進細胞異常增殖或凋亡，從而調控炎癥的發(fā)生、發(fā)展。我們觀察了頭花蓼灌胃對大鼠幽門螺桿菌相關性胃炎的治療作用，并探討其機制。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、實驗動物、試劑及儀器 花蓼浸膏粉，批號為14196，由浙江眾義制藥有限公司提供。36只6～8周齡SPF級SD大鼠，體質量150～180g，購買于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號：SCXK2012-0001)。幽門螺桿菌國際標準測序株SS2000，由中國疾病控制中心傳染病所張建中教授惠贈；-80 ℃冰箱取出后室溫快速溶解混勻后傾倒于10%的哥倫比亞血瓊脂平板上涂抹均勻，置三氣培養(yǎng)箱內37 ℃培養(yǎng)72 h，微需氧(5% O2、10% CO2、85% N2、相對濕度>95%)，穩(wěn)定傳代3次后進行氧化酶試驗、觸酶試驗、尿素酶試驗及革蘭染色鑒定。Omega RNA提取試劑盒(寶生物公司)；RNA反轉錄試劑盒(公司)、熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)；組織蛋白提取試劑盒(萬類生物有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(鼎國生物技術有限公司)；AKT、p53、Bcl-2蛋白抗體(萬類生物有限公司)；兔抗β-actin抗體(博奧森生物有限公司)；酶標儀(美國Bio-Rad公司)，三氣培養(yǎng)箱(Thermo生產)，Western Blot電泳及轉膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，臺式低溫高速離心機(Sigma)，熒光定量PCR儀(德國ROCHE公司)。

1.2 大鼠分組、幽門螺桿菌相關性胃炎模型制備及頭花蓼給予方法 36只SD大鼠隨機分為頭花蓼組、模型組、空白組，每組12只。適應性飼養(yǎng)一周后禁食不禁水12 h用5g /L的NaHCO3和消炎痛混合液對各組大鼠進行灌胃預處理；預處理后繼續(xù)禁食不禁水6 h后，頭花蓼組、模型組予1 × 1011cfu/L的幽門螺桿菌標準菌株SS2000菌液1.5 mL/只灌胃，灌胃后禁食禁水4 h，每隔1天灌胃細菌一次，共灌胃5次；空白組以等量的無菌腦心浸液肉湯灌胃[3]。末次灌胃后正常飼養(yǎng)8周(使幽門螺桿菌在胃內有良好定植)，模型組、空白組各隨機抽取2只大鼠鑒定模型，股動脈放血處死大鼠并進行解剖，無菌條件下取少許胃竇部黏膜組織立即置于幽門螺桿菌快速尿素酶試紙上檢測。幽門螺桿菌定植后的SD大鼠胃黏膜出現(xiàn)慢性炎癥病理學改變，證實造模成功[4]。造模成功后按體型系數(shù)公式換算成SD大鼠的等效劑量，頭花蓼組每天給浸膏粉為1.58 g/(kg·d)灌胃?？瞻捉M和模型組給予等量無菌生理鹽水進行灌胃，1次/d,連續(xù)灌胃2周[3]。末次灌胃結束正常飼養(yǎng)4周后經(jīng)股動脈處死各組大鼠，取近幽門處胃黏膜，取胃黏膜組織于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 各組大鼠胃黏膜慢性炎癥情況觀察 取各組胃黏膜標本，HE染色后低倍鏡(100×)下觀察炎癥細胞浸潤情況。根據(jù)評分標準[4]高倍鏡(400×)下觀察10個視野黏膜炎性細胞情況，無炎性細胞計0分，有中性粒細胞計1分，有淋巴細胞計2分，有單核細胞計3分，嗜酸性粒細胞計4分；炎癥程度為無炎癥計0分，在胃黏膜表層或底部有少量散在的炎細胞計1分，在胃黏膜各部分均有較多的炎細胞計2分，炎細胞遍布黏膜全層或形成淋巴小結或成堆聚集計3分；胃黏膜糜爛：無糜爛計0分，被覆上皮細胞淺表損害計1分，胃小凹以上損害計2分，黏膜小凹以下?lián)p害計3分。測算各組胃黏膜組織病理學評分。

1.4 各組大鼠胃黏膜組織中AKT、p53、Bcl-2蛋白檢測 采用Western Blotting法。取各組胃黏膜標本，BCA法進行蛋白定量，30 μg/孔進行SDS-PAGE電泳，將電泳物轉置硝酸纖維膜上，含5%脫脂奶粉的TBST溶液于室溫搖床上緩慢封閉2 h，洗膜后進行AKT、p53、Bcl-2抗體(1∶500稀釋)孵育過夜。第二天洗膜與HRP標記的二抗(1∶20 000稀釋)于室溫共同孵育1 h。自動曝光，各取500 μL的A液和B液，作用1 min自動曝光。采用Image J灰度掃描軟件進行灰度掃描，掃描后的灰度值代表蛋白的相對表達量。

1.5 各組大鼠胃黏膜組織中AKT、p53、Bcl-2 mRNA檢測 采用 Real-time PCR法。采用Omega試劑盒，提取大鼠胃黏膜RNA，用酶標儀對提取的總RNA進行測定，計算OD260nm/OD280nm比值測定RNA濃度，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其的完整性。采用TaKaRa逆轉錄試劑盒，反應體系：2.5 μL總RNA，2.0 μL 15×Prime Script Buffer，0.5 μL Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ，0.5 μL RT Primer Mix，4.5 μL DEPC水，37 ℃作用15 min，85 ℃作用4 s。-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物參照primer blast上AKT、p53、Bcl-2的基因序列進行設計，由上海生工有限公司進行合成，以β-actin作為內參基因，見表1。20 μL反應體系：2.0 μL DNA模板，0.8 μL上、下游引物，10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，6.4 μL滅菌DEPC水。反應條件：95 ℃3 min，95 ℃7 s、57 ℃10 s、75 ℃15 s，40個循環(huán)。每組做3個生物重復，以2-ΔΔCt代表目標基因的相對表達量。

表1 AKT、p53、Bcl-2、β-actin引物序列

2 結果

2.1 各組胃黏膜組織學病理評分比較 頭花蓼組、模型組、空白組胃黏膜組織病理學評分分別為(1.73±0.40)、(5.33±1.16)、(0.67±0.58)分，空白組與模型組比較，P<0.05；頭花蓼組與模型組比較，P<0.05。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理學變化( HE，×100)

2.2 各組大鼠胃黏膜組織中AKT、p53、Bcl-2相對表達量比較 各組大鼠胃黏膜組織中AKT、p53、Bcl-2相對表達量比較見表2、圖2。

表2 各組大鼠胃黏膜組織中AKT、p53、Bcl-2相對表達量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠胃黏膜組織中AKT、p53、Bcl-2 mRNA相對表達量比較 各組大鼠胃黏膜組織中AKT、p53、Bcl-2 mRNA相對表達量比較見表3。

3 討論

幽門螺桿菌是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細菌，能夠穿過胃腸道粘液層，定居并刺激胃上皮細胞釋放多種細胞因子損傷胃黏膜[4]。幽門螺桿菌感染是慢性胃炎向萎縮性胃炎、腸化生、不典型增生及胃癌發(fā)展的啟動子，長期定植于胃黏膜可引起嚴重胃部疾病。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織中AKT、P53、Bcl-2蛋白表達情況

組別nAKT mRNAp53 mRNABcl-2 mRNA頭花蓼組121.700±0.226#2.200±0.211#1.678±0.201模型組123.844±0.791?1.476±0.0671.826±0.225?空白組121.022±0.1921.026±0.0591.027±0.015

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

頭花蓼是貴州傳統(tǒng)苗藥，具有清熱利濕、解毒止痛、活血散瘀等療效，對頭花蓼藥物活性的研究發(fā)現(xiàn)，頭花蓼具有較強的抗菌和抗炎機制[5]。課題組前期研究[6]表明，頭花蓼能夠調控幽門螺桿菌生長代謝及細胞周期，體內亦證實該藥可通過免疫調節(jié)、抑制胃腸激素紊亂及信號通路調節(jié)等多條途徑改善幽門螺桿菌感染相關性胃炎。

AKT、p53和Bcl-2是重要的細胞凋亡調控基因，其基因產物的異常表達可促使細胞異常增殖、抑制細胞凋亡[7]。AKT是細胞內關鍵蛋白，主要通過通過激活下游細胞因子p53、Bcl-2抑制細胞凋亡，促進細胞增殖[8]。p53是廣泛的腫瘤抑制基因，在細胞損傷修復、監(jiān)視基因組DNA方面具有重要作用[9]，其失控后能夠誘導異?；虮磉_、誘導細胞轉化和癌變、促進腫瘤發(fā)生[10]。p53主要通過調節(jié)下游的Bcl-2介導細胞凋亡、維持基因穩(wěn)定，防止細胞癌變。Bcl-2作為主要的抗凋亡蛋白參與細胞的線粒體凋亡途徑[11]，抑制細胞的程序性死亡，參與調節(jié)細胞凋亡[12]。當外界因素刺激時，Bcl-2常位于線粒體膜上的促凋亡蛋白Bax結合形成異源二聚體，從而啟動凋亡級聯(lián)反應，最后誘導細胞發(fā)生凋亡[13]。

研究[4]證實，細胞增殖與凋亡的失衡亦是造成幽門螺桿菌感染后慢性胃炎進行性發(fā)展的因素。本實驗研究結果顯示，幽門螺桿菌感染SD大鼠后，胃黏膜呈現(xiàn)慢性病理損傷， AKT、p53和Bcl-2 mRNA及蛋白表達明顯增高，提示幽門螺桿菌感染后可能激活了AKT信號通路，促進p53、Bcl-2活化，刺激胃黏膜上皮細胞凋亡，抑制其增殖，進而引起胃黏膜病理損傷。另外，可能還與調節(jié)CD4+T細胞凋亡有關，抗凋亡蛋白Bcl-2會抑制受損黏膜CD4+T細胞凋亡[14]，導致CD4+T細胞在黏膜持續(xù)過度聚集，引起大量炎癥因子釋放，導致黏膜炎癥慢性發(fā)作。賈振軍等[15]也證實幽門螺桿菌感染所致的慢性萎縮性胃炎伴異型增生中p53在轉錄水平上有過度表達。本研究發(fā)現(xiàn)，頭花蓼組SD大鼠的胃黏膜AKT、Bcl-2的表達明顯降低，p53表達升高，提示頭花蓼可抑制幽門螺桿菌感染所致的AKT信號通路的活化，Bcl-2表達降低，一方面抑制了凋亡級聯(lián)反應，促進胃黏膜增殖，有利于修復損傷的胃黏膜；另一方面也解除了黏膜CD4+T細胞的持續(xù)聚集作用，恢復胃腸道免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，從而緩解慢性胃炎癥狀。

此外，本研究中p53在幽門螺桿菌性胃炎中表達量較空白組升高，但無統(tǒng)計學差異，且經(jīng)頭花蓼治療后仍呈升高趨勢，推測可能是由于本研究大鼠胃黏膜炎癥屬于慢性萎縮性胃炎階段，并沒有發(fā)展到腸化生階段，因此表達量增高并不明顯，經(jīng)頭花蓼治療后很可能激發(fā)了p53的細胞損傷修復功能，通過p53呈現(xiàn)高表達狀態(tài)來緩解萎縮性胃炎的發(fā)生與發(fā)展。Bcl-2蛋白與基因表達量在幽門螺桿菌性胃炎中升高明顯，經(jīng)藥物治療后Bcl-2基因表達量下調不顯著且沒有統(tǒng)計學意義，但蛋白表達量顯著下調，可能存在翻譯后修飾的表達，且證實Bcl-2可能與胃黏膜萎縮性炎癥的發(fā)生有著密切的關聯(lián)并發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，頭花蓼可降低幽門螺桿菌相關性胃炎大鼠胃黏膜組織炎癥水平，其機制可能與其促進AKT、Bcl-2表達，降低p53表達有關。頭花蓼可能通過干擾AKT信號通路的部分因子的轉錄、表達發(fā)揮其抑制幽門螺桿菌相關性胃炎的作用，然而AKT信號通路的調控受多種因素的影響，關于頭花蓼對AKT通路更全面的調控機制還有待進一步研究。

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