林浩琪，劉雪萍，鄭銀麗，沈志濱，江濤，唐春萍,2

(1廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006；2 廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心；3 廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)

自然界95%的微生物能形成生物被膜[1]。皮膚癬菌是一種侵襲人或者動(dòng)物角質(zhì)層的真菌，包括毛癬菌屬、小孢子菌屬和絮狀表皮菌屬[2,3]。皮膚癬菌生物被膜[4]是皮膚癬菌菌體細(xì)胞被自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)包裹后所形成的聚合物，可導(dǎo)致皮膚癬菌耐藥。真菌種類[5]、基質(zhì)、 碳源、 酸堿環(huán)境和其他條件因素等[6]均可影響真菌生物被膜的形成。目前，關(guān)于真菌生物被膜的研究主要集中在白色念珠菌，而皮膚癬菌生物被膜形成的研究較少[7,8]。白色念珠菌屬假絲酵母菌，皮膚癬菌屬絲狀真菌，兩者生物學(xué)特性不同，且不同菌種之間孢子初黏附的時(shí)間與能力不同[8,9]。例如白色念珠菌成熟生物被膜的形成時(shí)間一般是24～48 h[9]、而紅色毛癬菌成熟生物被膜的形成時(shí)間一般是72～96 h[7]。本研究以紅色毛癬菌和犬小孢子菌為研究對象，構(gòu)建體外生物被膜模型，觀察其對特比萘芬(TERB)的敏感性。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、試劑與儀器 紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(F)T1d；犬小孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(F)M3h, 近平滑念珠菌ATCC-22019均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所(南京)，前期研究發(fā)現(xiàn)，紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜生長最適培養(yǎng)基為含胎牛血清培養(yǎng)基，初黏附時(shí)間分別為6、3 h。燕麥培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)配制[10]；含胎牛血清1640培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)配制[11]。噻唑藍(lán)(MTT)廣州瑞舒生物科技有限公司；XTT 鈉鹽(XTT)SIGMA-ALDRICH公司;鹽酸特比萘芬(TBF)美侖生物，批號(hào)：0726A； PB-10臺(tái)式數(shù)顯 PH 計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；BA310正置顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；AE2000倒置顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。iMark酶標(biāo)儀 (美國BIO-RAD公司)；DHP-9032B電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；E-1010離子濺射儀 (日本株式會(huì)社日立高新科技那珂事業(yè)所)；S-3400N掃描電鏡 (日本株式會(huì)社日立高新科技 那珂事業(yè)所)；CHA-S恒溫振蕩器 (江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 紅色毛癬菌、犬小孢子菌體外生物被膜模型構(gòu)建及其生長情況觀察 取紅色毛癬菌、犬小孢子菌標(biāo)準(zhǔn)菌分別接種于OCA和PDA培養(yǎng)基上，置于溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)兩代得到實(shí)驗(yàn)菌株，然后加入無菌PBS，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用胎牛培養(yǎng)基將菌懸液濃度調(diào)至適當(dāng)濃度，備用。將紅色毛癬菌和犬小孢子菌的菌液(1×106CFU/mL)分別接種到孔板中，分別在35 ℃溫箱中靜置孵育6、3 h(前期的研究結(jié)果表明紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜生長最適條件是在含胎牛血清的培養(yǎng)基中，初黏附時(shí)間分別為6、3 h)，棄培養(yǎng)基，0.01 mmol/L PBS沖洗2次，加入適量培養(yǎng)基，制作紅色毛癬菌、犬小孢子菌體外生物被膜模型。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)取出培養(yǎng)的紅色毛癬菌生物被膜模型；于培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)取出犬小孢子菌生物被膜模型，在倒置顯微鏡下用400倍觀察不同時(shí)間段生物被膜的生長狀況。加入100 μL XTT/menadione 溶液，35 ℃避光培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測定紅色毛癬菌和犬小孢子菌的光密度OD490值。不同時(shí)間點(diǎn)的光密度值即代表不同時(shí)間點(diǎn)被膜中孢子相的代謝程度，也就是生物被膜的生長狀況。

1.3 紅色毛癬菌和犬小孢子菌成熟生物被膜中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)檢測及形態(tài)觀察 培養(yǎng)96 h時(shí)取紅色毛癬菌生物被膜模型，培養(yǎng)72 h時(shí)取犬小孢子菌生物被膜模型，棄培養(yǎng)基，室溫干燥，分別加入50 μL的番紅精溶液，反應(yīng)5 min 后，棄去染液，加入PBS溶液沖洗直至上清液無色，分別在酶標(biāo)儀上測定紅色毛癬菌和犬小孢子菌的OD492值。以O(shè)D492值代表紅色毛癬菌和犬小孢子菌成熟生物被膜中ECM的相對表達(dá)量。培養(yǎng)96 h時(shí)取紅色毛癬菌生物被膜模型，將爬片標(biāo)本取出，于預(yù)冷2.5%的戊二醛溶液中避光固定4～6 h，用PBS浸洗 2 次，梯度乙醇( 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)進(jìn)行脫水，每次10 min，過夜干燥鍍金，使用掃描電鏡觀察紅色毛癬菌成熟生物被膜的形態(tài)。

1.4 紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜對特比萘芬(TERB)的敏感性觀察 參照文獻(xiàn)[12]比較紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜對TERB的敏感性。

1.4.1 TERB對于紅色毛癬菌和犬小孢子菌浮游菌最低抑菌濃度的測定 分別將100 μL 用普通培養(yǎng)基稀釋的紅色毛癬菌和犬小孢子菌菌液(2×104CFU/mL)接種于96孔板中，分為10組，每組5個(gè)復(fù)孔，分別加入100 μL終濃度為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6 μg/mL的TERB，并設(shè)未加藥的對照組，35 ℃培養(yǎng)96 h后取出，肉眼觀察無菌生長的濃度即為MIC。用近平滑念珠菌ATCC22019作為質(zhì)控菌株，氟康唑作為質(zhì)控菌的藥物，氟康唑?qū)交钪榫鶤TCC22019的MIC為2 μg/mL，符合CLSI質(zhì)控要求。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 TERB抑制紅色毛癬菌、犬小孢子菌50%和80%生物被膜濃度的測定 培養(yǎng)96 h時(shí)取紅色毛癬菌成熟生物被膜模型；培養(yǎng)72 h時(shí)取犬小孢子菌生物被膜模型，棄去培養(yǎng)基，分為10組，每組5個(gè)復(fù)孔。分別加入100 μL終濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL的TERB，并設(shè)未加藥的對照組，繼續(xù)在35 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h后，0.01 mmol/L PBS沖洗以除去藥液本身顏色對光密度值的影響；加入100 μL XTT/menadione 溶液，35 ℃避光培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測定OD490值。以O(shè)D490值代表TERB對于紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜的SMIC。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜生長情況 不同培養(yǎng)時(shí)間紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜形態(tài)比較見圖1。培養(yǎng)48 h時(shí)兩種菌株酵母相細(xì)胞與其延伸所形成的菌絲開始密集交織,培養(yǎng)72 h時(shí)兩種菌株開始大量形成ECM并沿著菌絲形成團(tuán)塊聚集，可見多層膜狀結(jié)構(gòu)，表明兩種皮膚癬菌體外生物被膜構(gòu)建成功。

注：紅色毛癬菌：(a)培養(yǎng)24 h；(b)培養(yǎng)48 h；(c)培養(yǎng)72 h；(d)培養(yǎng)96 h 犬小孢子菌:(e)培養(yǎng)24 h；(f)培養(yǎng)48 h；(g)培養(yǎng)72 h;(h)培養(yǎng)96 h。

圖1紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜形態(tài)(400×)

不同培養(yǎng)時(shí)間紅色毛癬菌和犬小孢子菌的OD490值比較見表1。紅色毛癬菌和犬小孢子菌形成成熟生物被膜的時(shí)間分別為96 、72 h。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間紅色毛癬菌和犬小孢子菌的OD492值比較

注：與同培養(yǎng)時(shí)間犬小孢子菌比較，*P<0.05。

2.2 紅色毛癬菌、犬小孢子菌成熟生物被膜OD492值比較

鏡下可見紅色毛癬菌和犬小孢子菌成熟生物被膜OD492值分別為1.925±0.111和1.173±0.157。

紅色毛癬菌成熟生物被膜菌絲相互纏繞連接，形成精密的被膜網(wǎng)，菌絲外圍清晰可見細(xì)胞外基質(zhì)，見圖2。

2.3 TERB對紅色毛癬菌和犬小孢子菌的MIC及SMIC50、SMIC80比較 TERB對紅色毛癬菌和犬小孢子菌浮游菌MIC分別是0.125、1 μg/mL，而TERB對于紅色毛癬菌和犬小孢子菌成熟生物被膜的SMIC50、SMIC80值均大于256 μg/mL。

3 討論

注：a為掃描電鏡下紅色毛癬菌成熟生物被膜形態(tài)，b、c、d箭頭所指為紅色毛癬菌成熟生物被膜ECM。

圖2紅色毛癬菌成熟生物被膜形態(tài)

由于生物被膜本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及對真菌生物被膜的研究較少，因此目前臨床上對真菌引起相關(guān)疾病仍缺少高效的治療藥物[13]。一般情況下，成熟的生物被膜能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，其組成成分很復(fù)雜，通常包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸等，其中多糖為生物被膜的主要成分[14]。目前對真菌生物被膜的研究主要集中在白色念珠菌上，但由于皮膚癬菌和白色念珠菌之間的生物學(xué)特性存在著較大的差異，由此研究皮膚癬菌生物被膜的特性對于后期篩選具有抗皮膚癬菌活性及抗耐藥性藥物具有重要的意義。

文獻(xiàn)[6]報(bào)道須癬毛癬菌生物被膜的成熟時(shí)間為72 h；白色念珠菌生物被膜的成熟時(shí)間為24～48 h[9]。本文用XTT法、倒置顯微鏡法探究紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜的生長動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明，紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜的指數(shù)生長期都在48～72 h，而其生物被膜完全成熟的時(shí)間分別是96、72 h。因此，生物被膜成熟時(shí)間因菌株不同而不同，可能的原因是不同菌種之間孢子初黏附的時(shí)間與能力不同，也可能是由于不同菌種之間生態(tài)差異和所含酶不同[8]。

文獻(xiàn)[5,7,15]報(bào)道，番紅精能夠?qū)CM中含量最高的有機(jī)多糖進(jìn)行染色，不同的菌種之間生物被膜的生成總量與ECM的生成量呈正相關(guān)。本研究采用了番紅精染色法分別對成熟期兩種菌株進(jìn)行染色，結(jié)果顯示紅色毛癬菌、犬小孢子菌均能產(chǎn)生較多有機(jī)多糖，即產(chǎn)生較多的ECM。本研究中，在掃描電鏡下觀察到紅色毛癬菌能在聚苯乙烯材料的表面形成成熟的生物被膜，成熟期的生物被膜菌絲之間相互交錯(cuò)，結(jié)合緊密，同時(shí)在某些區(qū)域上能觀察到內(nèi)嵌著菌絲的ECM。

按照M38-A2方案，測定氟康唑?qū)|(zhì)控菌近平滑念珠菌的MIC結(jié)果在參考范圍內(nèi)。本研究中測得TERB對紅色毛癬菌和犬小孢子菌浮游菌的MIC分別為0.125、1 μg/mL。接著探究TERB對形成產(chǎn)生成熟的生物被膜菌株的敏感性，結(jié)果顯示其SMIC50和SMIC80均>256 μg/mL。成熟的生物被膜對抗菌藥物的敏感性降低，降低的倍數(shù)往往是幾十倍甚至是幾百上千倍[16,17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅色毛癬菌、犬小孢子菌均能生成成熟生物被膜，TERB對紅色毛癬菌和犬小孢子菌的成熟生物被膜敏感性低，說明皮膚癬菌對TERB的耐藥性大大的增強(qiáng)，這也能從側(cè)面證明了本文已經(jīng)成功的構(gòu)建了皮膚癬菌的生物被膜體外模型。

本文通過研究毛癬菌屬和小孢子菌屬體外生物被膜的構(gòu)建方法和生物學(xué)特性，為進(jìn)行抗皮膚癬菌藥物的篩選、療效的評價(jià)和皮膚癬菌生物被膜的耐藥性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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