袁靜怡，曾嘉麗，帥春，劉玥，3

(1南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 510515；2 廣東省婦幼保健院；3廣東省生物芯片重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

胃癌是來(lái)源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率居于惡性腫瘤第五位[1]，病死率居于癌癥病死率第二位[2,3]。我國(guó)胃癌發(fā)病率居高不下[4]。目前臨床尚無(wú)有效的胃癌治療方法。扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同系物1(TWSG1,在非哺乳類(lèi)脊椎動(dòng)物中稱(chēng)為T(mén)sg)是一種高度保守的分泌蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅屬中[5],其表達(dá)產(chǎn)物是分泌型的BMP綁定糖蛋白，參與多種疾病的調(diào)控[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，TWSG1基因在膽管癌和肝癌組織細(xì)胞中的表達(dá)量比正常細(xì)胞明顯升高。在人惡性間皮瘤中，TWSG1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的異常甲基化可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存能力，或當(dāng)暴露于分化不利的條件時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性[8]。Alexandra 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中TWSG1可能是一個(gè)典型的癌癥抑制基因。因此，可推測(cè)TWSG1在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)育、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制存在差異。而有關(guān)于TWSG1基因在胃腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制相關(guān)報(bào)道較少。2016年1月～2017年6月，我們構(gòu)建TWSG1基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并用其轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823，觀察其對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 感受態(tài)大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室制備，人胃腺癌BGC-823細(xì)胞和pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-EGFP-F2A-PuroR質(zhì)粒為南方醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。BGC-823于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(內(nèi)含10%滅活小牛血清+1%雙抗(100 units/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素)。細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行常規(guī)更換培養(yǎng)液與傳代操作。質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)、限制性?xún)?nèi)切酶、DNA Ladder、核酸膠回收試劑盒，以及T4DNA連接酶和Taq聚合酶(Takara公司)，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，Trizol(Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex Taq TMⅡKit(Takara公司),RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，PVDF膜(millipore公司)，TWSG1兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京天德悅公司)，ECL發(fā)光液(美國(guó)Thermo Scientific Pierce公司)，CCK8(日本DOJINDO)。細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning公司)、六孔板(Corning公司)、EP管(Corning公司)和八聯(lián)管(Corning公司)。測(cè)序由上海生工公司完成，克隆引物和RT-qPCR引物由上海生工公司合成。離心機(jī)(Beckman公司)； Infinite M200酶標(biāo)儀(Tecan公司)；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo公司)；小型水平電泳儀(Bio-Rad公司)；EclipseTi-s熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)；7500Real-TimePCR儀(AppliedBiosystems公司)。

1.2 TWSG1基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 擴(kuò)增TWSG1基因，上下游引物分別為5′- GAATTCATGAAGTTACACTATGTTGCTGTG-3′；5′- GGATCCTTAAAACATGCAGTTCATACATTTG-3′，反應(yīng)條件為95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物和pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-EGFP-F2A-PuroR質(zhì)粒同時(shí)采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取陽(yáng)性菌落。菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后按照天根質(zhì)粒小提試劑盒步驟進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度及純度，用EcoR Ⅰ和BamH I進(jìn)行雙酶切鑒定，根據(jù)DNA Ladder鑒定目的基因克隆的正確性，并將酶切鑒定為陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3 BGC-823細(xì)胞分組及TWSG1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，將細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組，待細(xì)胞匯合率達(dá)70%～80%時(shí)觀察組和對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染TWSG1真核表達(dá)質(zhì)粒、空白質(zhì)粒載體，所有操作均按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后加入1 μg/mL嘌呤霉素篩選至出現(xiàn)單克隆，取多個(gè)單克隆分別加入0.5 μg/mL嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)，篩選穩(wěn)定表達(dá)TWSG1的細(xì)胞株。經(jīng)鑒定后觀察組重組表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果測(cè)序結(jié)果與NCBI收錄的人TWSG1基因序列完全相同。

采用Real-Time PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞TWSG1基因。采用TRIzol提取總RNA，擴(kuò)增TWSG1基因，上下游引物分別為5′-GGTCATATGAGAAGCAGGTG-3′；5′-GTGTGCTAACAGTAGCACATG-3′，以GAPDH為內(nèi)參，上下游引物分別為5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′；5′-CATACCAGGAAATGAGCTTGAC-3′，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。TWSG1相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]。 采用Western blotting法檢測(cè)TWSG1蛋白。收集各組細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉后加入一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶6 000稀釋)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光。用圖像分析系統(tǒng)分析,以相應(yīng)目的蛋白條帶的積分光密度值表示TWSG1蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 兩組細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。取轉(zhuǎn)染48 h各組細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)9孔，每孔約1×103個(gè)細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)3天。分別于24、48、72 h取出3孔細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱孵育4 h后，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄各組光密度值(OD值)。

2 結(jié)果

兩組細(xì)胞TWSG1基因及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞TWSG1基因及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05。

培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)兩組細(xì)胞OD值比較見(jiàn)表2，兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)觀察組細(xì)胞OD值均降低(P均<0.05)。

表2 培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)兩組細(xì)胞OD值比較

注：與空白組、對(duì)照組比較，*P<0.05；與本組前一培養(yǎng)時(shí)間比較，#P<0.05。

圖2 兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3 討論

TWSG1基因編碼保守性的疏水蛋白，在非洲爪蟾蜍中，Tsg通過(guò)其與腱蛋白相似的富含半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域直接與BMPs結(jié)合[10]。目前關(guān)于TWSG1的大部分研究是探討其通過(guò)BMP信號(hào)調(diào)節(jié)鐵調(diào)素的表達(dá)，有研究認(rèn)為T(mén)WSG1能下調(diào)鐵調(diào)素的表達(dá)[11,12],其機(jī)制可能與BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。Forsman 等[13]發(fā)現(xiàn)TWSG1可通過(guò)激活BMP信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺導(dǎo)管分支、簇狀結(jié)構(gòu)形成等發(fā)育過(guò)程，而Yamada 等[14]發(fā)現(xiàn)在腎小球硬化癥中 TWSG1是BMP主要的負(fù)調(diào)節(jié)因子。目前關(guān)于TWSG1的大部分研究是探討其通過(guò)BMP信號(hào)調(diào)節(jié)鐵調(diào)素的表達(dá)，TWSG1能下調(diào)鐵調(diào)素的表達(dá)[15,16],其機(jī)制可能與BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[17]，Tanno 等[18]發(fā)現(xiàn)TWSG1在β-球蛋白生成障礙性貧血老鼠中表達(dá)顯著上調(diào)。同時(shí)，國(guó)內(nèi)有研究[19]發(fā)現(xiàn)TWSG1在慢性高原病大鼠的肝組織中表達(dá)上調(diào)。此外，TWSG1參與許多生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，Tanno 等[20]發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控早期胚胎發(fā)育， Heinke 等[21]認(rèn)為其參與血管細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)。

從目前的研究狀況來(lái)看，TWSG1對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞的調(diào)控具有雙向性，有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中TWSG1可能是一個(gè)典型的癌癥抑制基因[9],其在許多結(jié)直腸癌組織中檢測(cè)到存在缺失。此外，F(xiàn)orsman 等[22]發(fā)現(xiàn)在小鼠乳腺發(fā)育的重要時(shí)間點(diǎn)均有TWSG1的表達(dá)，其對(duì)乳腺癌的發(fā)生起到重要作用。而Xia 等[23]發(fā)現(xiàn)TWSG1在轉(zhuǎn)移型乳頭狀甲狀腺癌中的表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移型乳頭狀甲狀腺癌，敲低TWSG1的表達(dá)能夠抑制轉(zhuǎn)移型乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，由此推斷其可能是乳頭狀甲狀腺癌的新型診斷以及治療靶點(diǎn)。他們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)TWSG1在K1細(xì)胞表達(dá)下調(diào)時(shí)，Id1和p-Smad1/5的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降。而當(dāng)TWSG1在TPC1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)Id1和p-Smad1/5的表達(dá)也增強(qiáng)。他們推論TWSG1可以激活乳頭狀甲狀腺瘤細(xì)胞中的BMP信號(hào)通路。Johnston 等[7]通過(guò)對(duì)含有肝癌和膽管細(xì)胞癌的組織芯片進(jìn)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)免疫組化和WB的結(jié)果均顯示膽管細(xì)胞癌的TWSG1表達(dá)量高于肝癌，且高表達(dá)于上皮細(xì)胞區(qū)域，而通過(guò)免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)BMP4也高表達(dá)于膽管細(xì)胞癌，此差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。于此同時(shí)，他們檢測(cè)到TWSG1高表達(dá)于人膽管細(xì)胞癌細(xì)胞系(OZ;Huh-28;HuCCT-1)和人肝癌細(xì)胞系HepG2,但是在人肝正常上皮細(xì)胞THLE-3內(nèi)不表達(dá)。而通過(guò)WB技術(shù)發(fā)現(xiàn)BMP4也高表達(dá)于人膽管細(xì)胞癌細(xì)胞系(OZ;Huh-28;HuCCT-1)，在HepG2和THLE-3細(xì)胞中均有一定表達(dá)。因此他們推斷肝癌和膽管細(xì)胞癌組織中TWSG1的高表達(dá)能夠激活BMP4分子，進(jìn)而激活BMP信號(hào)通路。

然而，關(guān)于TWSG1對(duì)胃癌的作用的研究報(bào)道就十分有限，有研究[24]發(fā)現(xiàn)NKX6.3是小鼠胃部幽門(mén)中G/D細(xì)胞系的一種選擇性調(diào)控因子，其可直接結(jié)合TWSG1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的啟動(dòng)子上游序列，從而提高TWSG1的mRNA和蛋白表達(dá)量。與此同時(shí)，NKX6.3并不會(huì)影響B(tài)MPR-II蛋白表達(dá)量。接著通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)在AGS細(xì)胞和MKN1細(xì)胞中NKX6.3誘導(dǎo)TWSG1與BMP4分子結(jié)合，并抑制BMP4分子與BMPR-II分子的結(jié)合，而沉默NKX6.3或TWSG1基因能使BMP4分子重新與BMPR-II分子結(jié)合。當(dāng)BMP4分子與BMPR-II分子的結(jié)合受到抑制時(shí)，能導(dǎo)致BMP-SMAD信號(hào)通路失活，最終抑制胃黏膜的腸化生，減少胃癌的發(fā)生率。

綜上所述，TWSG1基因過(guò)表達(dá)可抑制BGC-823細(xì)胞的增殖。

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